EML4—ALK融合基因检测在实际工作中应用的体会

摘要：随着靶向药物与个体化治疗的发展与广泛应用，肿瘤治疗已经进入到分子靶向治疗的时代。现代分子诊断技术的靶点检测是分子靶向治疗的前提，EML4-ALK融合基因发现主要表达于非小细胞肺腺癌中，利用高灵敏度和特异性的检测系统，将有助于筛选EML4-ALK融合基因阳性非小细胞肺癌患者。

关键词：EML4-ALK 融合基因 非小细胞肺癌 靶向治疗

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占80%.EML4-ALK融合基因被发现存在于部分非小细胞肺癌中。该融合基因常见于不吸烟的肺腺癌患者，有其独特的病理学特征，可以诱导肿瘤生成。ALK抑制剂能够作用于该基因的下游信号传导通路并拮抗其促肿瘤生成活性。近年来靶向治疗药物对特定基因型的非小细胞肺癌患者有明显的治疗作用，因此，有效的筛选出EML4-ALK融合基因阳性NSCLC是指导患者治疗的关键。

目前，利用患者的组织标本检测EML4-ALK融合基因的方法，常用的有荧光原位杂交技术（FISH），RT-PCR技术，免疫组化（IHC）及cDNA末端快速扩增技术均可检测EML4-ALK融合基因， 哪种检测方法更快捷、灵敏度和特异性更高成为了大家面临的新问题。现对我院开展的常用EML4-ALK融合基因检测方法进行比较如下：

1. RT-PCR检测：在非小细胞肺癌的病例中，多种EMLA-ALK融合基因的突变体己经被发现，多数是由于EML4基因的断裂点不同导致，因此精确诊断EML4-ALK阳性肿瘤需要检测EML4基因和ALK基因cDNA的所有融合方式，现已发现并确认至少9种EML4-ALK融合基因的突变体，在目前已知EML4-ALK融合转录突变体的基础上，采用三条引物组成的多重RT-PCR技术检测目前已知的多种突变体。且由于EML4-ALK为倒位融合，野生型组织细胞采用该RT-PCR不会产生扩增条带。该方法基于PCR技术，敏感且特异性好，粗略明确EMLA-ALK融合突变体。但也存在一些不足，对于潜在的非EML4基因与EML4-ALK融合则不能被检测到，而且对于潜在的EML的第21个外显子与ALK融合的转录突变体长度达1284bp，可能难于检测到。而且在实际工作中，对于一些肺部穿刺的活检标本因为量太少而无法检测。

2.荧光原位杂交（FISH）检测：该技术可以从病理切片或细胞涂片上检测少数细胞的融合变异。FISH方法具有高度灵敏度和特异性及高度重复性和可靠性，但探针的价格高，而且有限的探针片段有时会降低其敏感性，与其他实验技术一样也受到一些因素的影响，如标本固定时间过长，烤片温度过高，蛋白消化不当，变性的温度差异等，都会使信号减弱或无信号。且荧光原位杂交在评估染色结果时有一定的技术难度。

3. 免疫组化检测：可检测肿瘤特异性抗原的表达，但传统免疫组化试剂灵敏度较低，易出现假阴性结果。新推出的抗ALK（D5F3）兔单克隆抗体在试剂盒中使用增强DAB染色液和增强扩增试剂，使检测结果的灵敏度和特异性都明显提高

3.1 抗体类型：Mino-Kenudson等针对ALK融合基因的新型抗体（美国细胞信号转导技术公司的兔单克隆抗人CD246抗体克隆号：D5F3 或D9E4）采用免疫组化法筛查来自临床的石蜡标本并通PCR和荧光原位杂交技术等检测方法进行验证结果显示，与传统检测淋巴瘤ALK表达的小鼠来源标准抗体（克隆号：5A4）相比灵敏度和特异性均有明显提高。

3.2 检测组织的来源：手术切除的组织、针吸活检组织、支气管镜活检组织以及来自于细针穿刺物。标本及时用10%中尔马林固定，经梯度酒精脱水，二甲苯透明和浸蜡后，石蜡包埋成蜡块。

3.3 检测方法：切取3μm石蜡切片，60℃烤片过夜，脱蜡至水，利用罗氏诊断的抗ALK（D5F3） 兔单克隆抗体免疫组化检测试剂盒。该检测需要一套组织切片用于H&E染色，第二套组织切片用于抗ALK（D5F3）兔单克隆抗体染色，以及第三套组织切片用于兔单克隆阴性的质控抗体。试剂盒中使用增强DAB染色液和增强扩增试剂，并在VENTANA BenchMark XT/GX平台上完成染色。

3.4 质量控制：用一例已知ALK 阳性的非小细胞肺癌病例和一例ALK阴性的非小细胞肺癌病例可作为系统水平的质控，以确保染色仪器系统和相关检测试剂的性能合乎要求。

4.小结

EML4-ALK融合基因作为NSCLC的一个新亚型，其临床意义正逐渐体现，通过研制开发EML4-ALK融合基因检测试剂，对指导临床用药、降低临床检测成本将产生积极意义。针对ALK的靶向治疗将促使肺癌个体化治疗更加精准有效和逐步走向成熟完善。与此同时，对EMI4-ALK融合基因的检测方法也将逐步实现标准化。

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