浅议体外药物肝代谢研究进展

【摘要】 目的: 介绍药物体外肝代谢方法的最新进展. 方法: 根据近几年的文献资料进行分析、综合、归纳. 分别按肝微粒体体外温孵法、肝细胞体外温孵法、肝匀浆体外孵育法进行介绍. 结果:体外肝代谢研究方法发展迅速. 结论: 目前主要的药物体外肝代谢方法各有利弊,但对于新药开发来都是必不可少的研究手段.

【关键词】 肝 代谢;微粒体,肝;肝细胞;药代动力学

0 引言

肝脏是药物主要的和重要的代谢器官,是药物生物转化的主要场所,是富含参与药物代谢的一个庞大的依赖细胞色素P450的混合功能氧化酶系统,大多数药物的Ⅰ相和Ⅱ相代谢反应都是在肝药酶系统的参与下发生的,因此药物的体外代谢模型主要是以肝脏为基础的,并以其特有的优势和特点在药物代谢的研究中得到广泛的应用. 体外药物的肝代谢研究已经发展很长时间,与体内代谢研究相比,体外代谢研究有许多优点,①体外代谢研究可以排除体内诸多的干扰因素,直接观察到代谢酶对底物的选择性代谢,为体内代谢研究提供重要的线索和依据. ②对于体内代谢转化率低且缺乏灵敏检测手段的药物来说,体外代谢不失为一种很好的研究手段. ③体外代谢研究具有快速简便的特点,适合大量化合物的药动学筛选. ④不需要消耗大量的样品和实验动物,因而研究费用相对较低[1]. 我们从体外肝代谢模型入手,综述了近年来药物体外肝代谢的文献.

1 肝微粒体体外温孵法

肝微粒体体外温孵实验是采用从肝脏中提取的肝微粒体,并加入还原型辅酶II(NADPH)再生系统,在体外模拟生理环境下进行代谢反应,采用高效液相色谱(HPLC)、高效液相色谱质谱联用法(HPLCMS)等测定方法对原型药及代谢产物进行测定的一种体外代谢的实验方法.

1.1 Ⅰ相代谢 Ⅰ相代谢又称为官能团反应,包括氧化、还原、水解、水合等反应. NADPH为还原型酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,是许多药物生物转化反应中不可缺少的辅助因子,它在这些反应中起到还原剂的作用,体系中只要NADPH浓度达到1 mmol/L时,便足以维持药物代谢反应进行,但NADPH价格较高,且不易长时间保存. 因此常采用NADPH再生系统来代替NADPH. 即利用相对稳定和廉价的辅酶II(NADP)与6磷酸葡萄糖在6磷酸葡萄糖脱氢酶的作用下生成NADPH.

6磷酸葡萄糖+NADP 6磷酸葡萄糖脱氢酶

6-磷酸葡萄糖内脂+NADPH

文献[2]研究了吡喹酮在大鼠肝微粒体内的代谢情况,发现在不同诱导剂对大鼠肝微粒体诱导后其羟基化代谢产物不同. 姚庆强等[3]则利用大鼠肝微粒体温孵实验对黄皮酰胺的正反异构体的代谢情况进行了考察,并采用HPLCMS对其代谢产物进行定性和定量,发现右旋和左旋的黄皮酰胺均代谢产生3去氢黄皮酰胺. 姜敏等[4]应用CYP3A特异性诱导剂地塞米松、CYP2B诱导剂苯巴比妥、CYP1A诱导剂β-萘黄酮分别对Wister大鼠进行在体诱导, 建立肝微粒体温孵及NADPH再生体系, HPLC紫外检测法测定. 研究结果提示甲基莲心碱具有酶促动力学代谢特性; CYP3A及CYP2B是介导甲基莲心碱在大鼠体内生物转化的CYP450亚酶, 其中主要参与甲基莲心碱代谢的为CYP3A. 王汝涛等[5]研究了染料木黄酮在大鼠肝微粒体代谢的酶动力学,研究发现CYP1A2 参与了染料木黄酮的代谢, CYP1A2 的抑制剂可能会与染料木黄酮发生代谢相互作用, 从而降低染料木黄酮的代谢速率. 曹露晔等[6]研究了蓝萼甲素在大鼠体内外的代谢转化,发现蓝萼甲素在大鼠肝微粒体和胆汁中可被代谢转化, 主要代谢产物为羟基化蓝萼甲素. Sung等[7]研究了KR60436(一种钠钾ATP酶抑制剂)在大鼠和人肝微粒体中的代谢情况,发现在两种微粒体中KR60436可产生7种氧化代谢产物,其中4种为氧化代谢产物. Anne等[8]采用大鼠和人肝微粒体孵育体系,对rhazinilam进行体外孵育,发现其在大鼠肝微粒体中可被氧化为3种代谢产物,并确定CYP2B6为主要的药物代谢酶.

1.2 Ⅱ相代谢 Ⅱ相代谢又称结合反应,包括糖苷结合、硫酸化、甲基化、乙酰化等反应. 一般认为Ⅰ相反应使药物产生或去掉一个基团,从而使Ⅱ相反应得以发生. 因此Ⅱ相反应是真正的解毒途径,它大部分生成药物的非活性形式而排除体外. 目前采用肝微粒体体外孵育反应主要集中在药物的葡醛酸化反应,通过肝微粒体与UDPGA孵育得到该药物的葡醛酸化结合物,并考察其酶动力学.

栾连军等[9]用高效液相色谱法分离测定大鼠肝微粒体中普萘洛尔葡醛酸化代谢产物,通过体外孵育得到外消旋普萘洛尔两种对映体的葡醛酸化代谢产物. 采用不同诱导剂对大鼠肝微粒体诱导后,采用体外孵育的方法,对氧氟沙星对映体葡醛酸化代谢进行研究,结果表明不同诱导剂诱导的大鼠肝微粒体对氧氟沙星对映体代谢有明显的影响. 裘雅渔等[10]对大鼠肝微粒体体系中银杏萜内酯代谢进行考察,通过HPLCELSD对银杏萜内酯剩余量的测定,考察其酶动力学,结果表明,银杏萜内酯在该体系下代谢较慢. Sabine等[11]对几种短链的脂肪醇葡醛酸化代谢进行研究,采用人肝微粒体孵育体系,并采用GCMS进行测定,同时测定其酶动力学. 结果发现,对于短链脂肪醇来说,不止一种Ⅱ相代谢酶催化其代谢反应. Rangaraj等[12]研究了氟派啶醇在大鼠肝微粒体的葡醛酸化反应,并采用HPLC/MS/MS测定. 结果表明,Ⅱ相代谢酶UGT2B12,UGT 2B1为该药物的主要催化酶.

2 肝细胞体外温孵法

肝细胞体外孵育法与肝微粒体法相似,即以制备的肝细胞辅以氧化还原辅酶,在模拟生理环境条件下进行代谢反应的体系. 培养体系中的肝细胞可以很好地模拟体内肝脏的生理环境, 在研究外源性化合物的生物活性、毒性、毒理机制、代谢命运和致癌性检测等方面有许多优势, 被认为是药物临床前毒性检测的可靠模型[ 13 ]. Born等[14]利用新鲜分离的鼠肝细胞检测了香豆素的代谢产物, 发现香豆素经肝细胞代谢产生的香豆素环氧化物和该环氧化物的代谢产物0羟苯乙醛是引起肝毒性的主要原因. Yoshihiro等[15]利用新鲜分离的肝细胞考察了十几种化合物的体外清除率, 并与体内血浆清除率比较, 发现两种方法一致性较好, 在药物研发中有很好的应用前景. 曹国颖等[16]考察了那格列奈在大鼠游离肝细胞中的代谢特点,结果表明CYP450同工酶CYP2D6和CYP2C9在那格列奈羟基化过程中起重要作用.

3 肝匀浆体外温孵法

上述采用的体外肝代谢都比较复杂,操作比较烦琐,因此目前很多研究人员为了简化实验,直接采用将肝脏匀浆的办法,将药物加入到肝匀浆溶液中,考察其在肝匀浆液的代谢情况来说明药物在肝脏中的代谢情况. 陈聪颖等[17]将槐苷在大鼠肝匀浆液中孵育,采用RPHPLC法测定槐苷及其代谢产物. 研究表明,其主要代谢产物为苷元. 李文兰等[18]研究了邻苯二甲酸丁基苄酯在不同性别小鼠肝匀浆中的生物降解. 结果表明,邻苯二甲酸丁基苄酯在肝脏中代谢有明显的性别差异. 陈怀侠等[19]采用液相色谱-串联质谱法分析大鼠山莨菪碱肝匀浆代谢物. 结果在大鼠肝匀浆培养液中发现了脱水山莨菪碱,说明山莨菪碱在大鼠肝脏中可以被代谢. 吕承等[20]将灯盏乙素与的家兔小肠内容物、肝组织匀浆和血浆在37℃孵育. 结果表明灯盏乙素体外不稳定, 在生物样品中降解迅速, 肝脏、血液、小肠等都是灯盏乙素可能的降解部位. 林文辉等[21]研究了布洛芬离体肝代谢中对映体间的相互作用,发现在手性转化代谢过程中存在对映体的相互作用, 即S (+)-布洛芬可以抑制R (-)-布洛芬的转化.

4 结语

综上所述, 常用的体外肝代谢研究方法有肝微粒体体外孵育法、肝细胞体外孵育法及肝匀浆体外孵育法. 这三种方法各有利弊,其中肝微粒体体外孵育法在体外肝代谢研究中应用最为广泛. 该方法与其他体外肝代谢相比,具有酶制备技术简单、代谢过程快、结果重现性好、易于大批量操作等优点,但该法所得的结果与体内代谢的一致性方面存在不足,需要体内代谢结果的验证. 而肝细胞体外孵育法主要应用在药物的体外代谢清除率方面,但肝细

胞制备技术比较复杂,同时制备好的肝细胞在体外的活性只能维持4h,不利于储存和反复使用. 肝匀浆体外孵育法是一种最简单的体外肝代谢孵育方法,具有制备简单、实验时间短等优点,但由于在肝匀浆液中各种酶比较复杂,因此对于样品处理及测定方法来说干扰比较大,而且肝匀浆液很容易失活,这也是其应用不太广泛的原因之一. 除了上述三种主要体外肝代谢方法外,还有肝组织切片法,该方法的优点在于可以保留所有的肝药酶及细胞器的活性,对于某些药物代谢研究来说,有时采用肝组织切片技术比肝微粒体孵育更好. 但由于该技术需要切片机等特殊的设备,因此近年来已经很少被采用.

总之,药物的体外肝代谢作为考察药物代谢的技术之一,随着时间的推移在今后会越来越受到人们的重视,必将成为药物代谢领域里必不可少的组成部分.

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