杜仲叶化学成分的研究

[摘要] 杜仲叶来源于杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides的干燥叶。为了深入了解杜仲叶中的活性成分，该研究采用D-101大孔树脂，MCI树脂，反相ODS，Sephadex LH-20，Rp-HPLC制备柱色谱法和重结晶等方法，从杜仲叶乙醇提取物的正丁醇萃取部位中分离得到10个化合物，通过MS和NMR等谱学方法，鉴定结构为山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷（1），槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷（2），槲皮素（3），槲皮素-3-O-β-D-木糖基-（12）-β-D-葡萄糖苷（4），山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-（16）-β-D-葡萄糖苷（5），（2S，3S）-（-）-花旗松素-3-O-β-D-葡萄糖苷（6），4-羟基肉桂酸（7），（+）-环橄榄脂素（8），松脂素-β-D-葡萄糖苷（9），角鲨烯（10），其中化合物1，5～7，10为首次从该属植物中分离得到。采用DPPH自由基清除法对分离得到的化合物进行抗氧化活性研究。结果显示，其中化合物2表现出显著的自由基清除能力（IC50为13.7 μmol·L-1），活性强于Vit C（IC50为59.9 μmol·L-1）；化合物1，3，9显示中等强度自由基清除能力（IC50分别为161，137，214 μmol·L-1），活性弱于Vit C，但强于2，6-二羟丁基对甲酚（IC50为236 μmol·L-1）；化合物4，6自由基清除能力较弱（IC50分别为264，299 μmol·L-1）；提示杜仲的药理作用，可能与其黄酮和木脂素类化学成分具有能够体内清除体内活性氧及抗氧化成分有关。

[关键词] 杜仲叶；化学成分；黄酮；木脂素；DPPH自由基清除法抗氧化活性

[收稿日期] 2013-11-27

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81071037）；陕西省教育厅科技计划项目（09jk394）

[通信作者] 宋小妹，Tel：（029）38185165，E-mail：； 梅其炳，Tel：（029）84779212，E-mail：

中药杜仲为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliver.的干燥树皮，味甘、性温，归肝、肾经，具有补肝肾、强筋骨等功效，主要用于肝肾不足、腰膝酸痛、筋骨无力、头晕目眩等[1]。本课题组前期研究中发现在去卵巢（OVX）大鼠骨质疏松模型上，杜仲提取物表现出较好的预防绝经后骨质疏松症的作用，与雌激素相比具有无子宫刺激的优点[2]，然而其抗骨质疏松作用的物质基础并不明确。文献研究表明体内活性氧及抗氧化成分羟自由基SOD、MDA及GSH-Px等可能参与绝经后骨质疏松的病理过程[3-4]，由于杜仲富含黄酮、木脂素等多酚类化合物[5]，本研究推测杜仲抗骨质疏松作用可能是通过其能够影响活性氧及抗氧化成分有关。因此，拟开展了杜仲化学成分的研究，并进行抗氧化活性测试，为揭示杜仲抗骨质疏松的药理作用奠定基础。另外，由于杜仲的采集为15年以上植物的树皮，杜仲叶与杜仲皮具有相似化学成分和药理作用[6]，为了珍惜、保护及充分利用资源，本实验采用活性追踪的方式对杜仲叶化学成分进行了深入研究。通过采用D-101大孔树脂、MCI树脂、反相ODS，Sephadex LH-20、Rp-HPLC制备柱色谱法和重结晶等方法，从中分离出10个化合物，并将分到的化合物通过1，1-二苯基-2-苄基苯肼自由基清除法（DPPH法）来评价其抗氧化活性。

1 材料

Bruker-AVANCE 500核磁共振仪；Waters Quattro Premier型和Agilent Technologies 6550 Q-TOF质谱仪以及Agilent Technologies 6520 Accurate-Mass-Q-TOF LC-MS液质联用仪；Combiflash Rf 200快速制备色谱仪（Isco公司）；Waters 2695高效液相色谱仪，Shimadzu LC-6AD型高效半制备液相色谱仪（Ultimate XB-C18或Allsphere ODS-2制备柱）；Molgene 1810a型纯水仪；RV 10D digital FLEX型旋转蒸发仪（IKA公司）；DLSB-5/20型低温冷凝循环泵（郑州科工贸公司）；D-101大孔树脂（西安蓝晓科技新材料股份有限公司）；MCI-CHP-20树脂（日本三菱公司）；ODS-C18填料（加拿大SiliCycle 公司）、Sephadex LH-20（瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB公司）；柱色谱硅胶（100～200，200～300 目）均为青岛海洋化工厂产品，薄层硅胶为烟台江友硅胶发展有限公司生产；本实验所用试剂均为天津科密欧公司分析纯和色谱醇产品。

药材于2009年7月采自陕西省安康市石泉县，经陕西省药检所郭耀武教授鉴定为杜仲科植物杜仲E. ulmoide的叶，标本现存秦巴山区中药发展协同创新中心，标签为杜仲叶样本。

2 提取与分离

杜仲湿叶18 kg恒温干燥（40 ℃）得干叶9 kg。 95%乙醇回流提取3次，每次1.5 h。将95%乙醇提取液减压浓缩至流浸膏，悬浮于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。取正丁醇层部分经D-101大孔树脂吸附，分别用水，20%，40%，60%，80%，95%的乙醇梯度洗脱，减压回收溶剂，分别得到20%乙醇洗脱部分（82.1 g），40%乙醇洗脱部分（73.9 g），60%乙醇洗脱部分（47.3 g），80%乙醇洗脱部分（34.5 g），95%乙醇洗脱部分（29.8 g）。40%乙醇部分（73.9 g）经Flash制备色谱分离，甲醇-水洗脱（30∶70～100∶0）梯度洗脱，得Fr. I（5.7 g），Fr. II（15.3 g），Fr. III（23.9 g），Fr. IV（17.4 g），Fr. V（16.1 g）和Fr. VI（17.4 g），Fr. IV经反相ODS柱色谱分离，甲醇-水（10%～80%））梯度洗脱，收集13个亚组分（Fr. IV-1～Fr. IV-13），Fr. IV-10经Sephadex LH-20，反相HPLC制备纯化及重结晶等方法得到化合物1（173 mg），2（257 mg）；Fr. IV-11经反相ODS，Sephadex LH-20和反相HPLC制备纯化得到化合物3（13.1 mg），4（57 mg），5（52 mg），6（6.1 mg）；Fr. IV-5经反复Sephadex LH-20和重结晶得到化合物7（1.5 mg），8（3 mg），9（4.2 mg），10（18.7 mg）。

3 结构鉴定

化合物1 黄色晶体，紫外254 nm下有暗斑，10%硫酸乙醇显色呈棕黄色；盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish 反应呈阳性。1H-NMR（Me2CO-d6 ，500 MHz）δ：6.27（1H，d，J=2.1 Hz，H-6），6.52（1H，d，J=2.1 Hz，H-8），8.13（2H，d，J=8.75 Hz，H-2′，6′），6.97（2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′），5.25（1H，d，J=7.5 Hz，H-1″），3.32（3H，br s，4′-OCH3），3.65（1H，d，J=11.6 Hz，H-6b″），3.52（1H，d，J=5.2 Hz，H-6a″），3.12～3.51（4H，m，H-2″～5″）；13C-NMR（Me2CO-d6，125 MHz）δ：161.1（C-2），135.5（C-3），179.3（C-4），163.1（C-5），94.8（C-6），165.3（C-7），99.8（C-8），158.7（C-9），105.6（C-10），122.7（C-1′），132.3（C-2′），115.9（C-3′），158.1（C-4′），115.9（C-5′），132.3（C-6′），104.9（C-1″），75.3（C-2″），78.1（C-3″），71.3（C-4″），77.9（C-5″），62.9（C-6″），49.9（4′-OCH3）。以上数据与文献[7]报道的山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷数据一致。

化合物2 黄色晶体，紫外 254 nm下有暗斑，10%硫酸乙醇显色呈棕黄色；盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish 反应呈阳性。1H-NMR（MeOH-d4，500 MHz）δ：7.59（1H，d，J=2.2 Hz，H-2′），7.46（1H，dd，J=2.2，8.5 Hz，H-6′），6.74（1H，d，J=8.5 Hz，H-5′），6.06（1H，d，J=2.1 Hz，H-6），6.25（1H，d，J=2.1 Hz，H-8），5.12（1H，d，J=7.6 Hz，H-1″），3.60（1H，dd，J=2.3，11.9 Hz，H-6b″），3.45（1H，dd，J=5.3，11.9 Hz，H-6a″），3.11～3.65（4H，m，2″～5″）；13C-NMR（MeOH-d4，125 MHz）δ：158.7（C-2），135.3（C-3），179.1（C-4），162.7（C-5），94.3（C-6），165.6（C-7），99.5（C-8），158.1（C-9），105.3（C-10），122.8（C-1′），115.6（C-2′），145.5（C-3′），149.5（C-4′），117.2（C-5′），122.7（C-6′），103.9（C-1″），75.4（C-2″），78.0（C-3″），70.8（C-4″），77.7（C-5″），62.2（C-6″）。以上数据与文献[8]报道槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷的数据一致。

化合物3 黄色粉末，紫外 254 nm下有暗斑，10%硫酸乙醇显色呈棕黄色；盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish 反应呈阴性。1H-NMR（MeOH-d4，500 MHz）δ：7.74（1H，s，H-2′），7.46（1H，d，J=8.2 Hz，H-6′），6.89（1H，d，J=8.2 Hz，H-5′），6.38（1H，s，H-8），6.18（1H，s，H-6）；13C-NMR（MeOH-d4，125 MHz）δ：149.0（C-2），137.5（C-3），177.6（C-4），162.7（C-5），94.7（C-6），166.0（C-7），99.6（C-8），158.5（C-9），104.7（C-10），124.4（C-1′），116.2（C-2′），146.5（C-3′），148.2（C-4′），116.5（C-5′），121.9（C-6′）。以上数据与文献[9]报道槲皮素的数据一致。

化合物4 黄色粉末，紫外 254 nm下有暗斑，10%硫酸乙醇显色呈棕黄色；盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish 反应呈阳性。1H-NMR（MeOH-d4，500 MHz）δ：7.64（1H，s，H-2′），7.63（1H，d，J=8.2，2.1 Hz，H-6′），6.88（1H，d，J=8.2 Hz，H-5′），6.38（1H，s，H-8），6.19（1H，s，H-6），5.35（1H，d，J=7.6 Hz，H-1″），4.79（1H，d，J=8.1 Hz，H-1），3.95（1H，dd，J=4.9，11.6 Hz，H-6b″），3.75（1H，dt，J =8.8 Hz，H-2″），3.72（1H，dd，J =2.3，11.6 Hz，H-6a″），3.20～3.63（8H，m，H-3″～5″，2～4，5a，5b）；13C-NMR（MeOH-d4，125 MHz）δ：158.8（C-2），135.4（C-3），179.8（C-4），163.2（C-5），100.3（C-6），166.8（C-7），95.0（C-8），158.7（C-9），105.8（C-10），123.7（C-1′），117.5（C-2′），146.3（C-3′），150.1（C-4′），116.4（C-5′），123.3（C-6′），100.3（C-1″），82.7（C-2″），78.3（C-3″），71.1（C-4″），75.1（C-5″），62.4（C-6″），105.7（C-1），77.2（C-2），78.5（C-3），71.2（C-4），66.9（C-5）。以上数据与文献[9]报道槲皮素-3-O-β-D-木糖基-（12）-β-D-葡萄糖苷的数据一致。

化合物5 黄色粉末，紫外 254 nm下有暗斑，10%硫酸乙醇显色呈棕黄色；盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish 反应呈阳性。1H-NMR（MeOH-d4，500 MHz）δ：8.05（2H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′），6.88（2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′），6.35（1H，s，H-8），6.20（1H，s，H-6），5.03（1H，d，J=7.1 Hz，H-1″），4.50（1H，d，J=1.2 Hz，H-1），3.79（1H，d，J=9.5 Hz，H-6b″），3.65（1H，br s，H-2″），3.54（1H，dd，J=3.3，9.5 Hz，H-6a″），3.25～3.50（8H，m，H-3″～5″，2～4，5a，5b），1.13（3H，d，J=6.2 Hz，H-6）；13C-NMR（MeOH-d4，125 MHz）δ：159.3（C-2），135.4（C-3），179.0（C-4），161.6（C-5），100.8（C-6），168.4（C-7），96.0（C-8），158.7（C-9），104.9（C-10），122.7（C-1′），132.3（C-2′），116.2（C-3′），162.7（C-4′），116.2（C-5′），132.3（C-6′），104.8（C-1″），73.8（C-2″），77.2（C-3″），71.4（C-4″），75.6（C-5″），68.3（C-6″），102.4（C-1），72.0（C-2），71.4（C-3），72.2（C-4），69.7（C-5），17.9（C-6）。以上数据与文献[10]报道山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-（16）-β-D-葡萄糖苷的数据一致。

化合物6 白色粉末，紫外 254 nm 下有暗斑，10%硫酸乙醇显色呈棕黄色，盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish 反应呈阳性。1H-NMR（MeOH-d4，500 MHz）δ：6.93（1H，s，H-2′），6.80（2H，m，H-5′，6′），6.21（1H，br s，H-8），6.19（1H，br s H-6），5.32（1H，J=9.0 Hz ，H-2 ），4.98（1H，d，J=9.0 Hz，H-3），4.78（1H，d，J=7.5 Hz，H-1″），3.88（1H，d，J=12.2 Hz，H-6b″），3.32-3.80（5H，m，H-2″～5″，6a″）；13C-NMR（MeOH-d4，125 MHz）δ：80.8（C-2），74.8（C-3），198.7（C-4），167.2（C-5），98.1（C-6），167.1（C-7），97.1（C-8），164.7（C-8a），101.4（C-4a），131.7（C-1′），116.4（C-2′），147.1（C-3′），146.6（C-4′），114.1（C-5′），119.5（C-6′），105.1（C-1″），71.3（C-2″），78.4（C-3″），70.3（C-4″），77.9（C-5″），62.5（C-6″）。以上数据与文献[11]报道（2S，3S）-（-）-花旗松素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷数据一致。

化合物7 白色粉末，紫外 254 nm下有暗斑，10%硫酸乙醇显色呈紫色。1H-NMR（MeOH-d4，500 MHz）δ：7.61（1H，d，J=15.9 Hz，H-7），6.29（1H，d，J=15.9 Hz，H-8），7.45（2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5），6.81（2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6）；13C-NMR（MeOH-d4，125 MHz）δ：161.3（C-1），116.8（C-2），131.2（C-3），127.5（C-4），131.2（C-5），116.9（C-6），146.7（C-7），115.8（C-8），171.3（C-9）。以上数据与文献[12]报道4-羟基肉桂酸的数据一致。

化合物8 白色粉末，紫外 254 nm下有暗斑，10%硫酸乙醇显色呈紫色；[α]20D+43.2（c 0.1，MeOH）。1H-NMR（Me2CO-d6，500 MHz）δ：6.78（1H，d，J=2.0 Hz，H-5），6.76（1H，s，H-2），6.64（1H，dd，J=2.0，8.1 Hz，H-6），6.61（1H，s，H-2′），6.16（1H，s，H-5′），4.15（2H，m，H-9），3.89（1H，m，H-7），3.54（2H，m，H-9′），2.60（2H，t，H-7′），2.09（1H，m，H-8），3.78（6H，br s，3，3′-OCH3）；13C-NMR（Me2CO-d6，125 MHz）δ：138.3（C-1），113.8（C-2），148.4（C-3），145.2（C-4），115.7（C-5），123.2（C-6），44.6（C-7），47.5（C-8），60.8（C-9），126.5（C-1′），112.7（C-2′），146.7（C-3′），145.9（C-4′），116.8（C-5′），133.6（C-6′），40.3（C-7′），74.1（C-8′），69.5（C-9′），56.4（3-OCH3），56.3（3′-OCH3）。以上数据与文献[13]报道（+）-环橄榄脂素的数据一致。

化合物9 白色粉末，紫外 254 nm 下有暗斑，10%硫酸乙醇显色呈紫色。1H-NMR（MeOH-d4，500 MHz）δ：7.02（1H，s，H-2），6.92（1H，d，J=8.3 Hz，H-5），7.15（1H，d，J=8.3 Hz，H-6），4.75（1H，d，J=4.0 Hz，H-7），4.25（2H，dd，J=7.9，13.2 Hz，H-9），6.94（1H，s，H-2′），6.79（1H，d，J=8.2 Hz，H-5′），6.80（1H，d，J=8.2 Hz，H-6′），4.71（1H，d，J=4.0 Hz，H-7′），3.69（2H，dd，J=7.9，13.2 Hz，H-9′），3.12（2H，m，H-8，8′），3.85（3H，s，3-OCH3），3.83（3H，s，3′-OCH3），4.83（1H，d，J=7.5 Hz，H-1″），3.2-3.8（6H，m，H-2″～5″，6a″，6b″）；13C-NMR（MeOH-d4，125 MHz）δ：136.1（C-1），110.3（C-2），149.6（C-3），147.7（C-4），114.7（C-5），118.7（C-6），86.1（C-7），54.1（C-8），71.3（C-9），132.3（C-1′），109.6（C-2′），149.3（C-3′），146.1（C-4′），116.6（C-5′），118.4（C-6′），85.7（C-7′），53.9（C-8′），71.2（C-9′），101.4（C-1″），73.5（C-2″），76.8（C-3″），69.9（C-4″），76.4（C-5″），61.1（C-6″），55.4（3-OCH3），55.1（3′-OCH3）。以上数据与文献[14]松脂素-β-D-葡萄糖苷的数据一致。

化合物10 白色晶体，紫外 254 nm下无暗斑，10%硫酸乙醇显色呈棕黑色。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：5.11～5.18（6H，m），1.89～2.13（20H，m），1.71（6H，s），1.63（18H，s）；13C-NMR（MeOH-d4，125 MHz）季碳信号135.3，135.1，131.4（3×2）；叔碳信号124.6，124.5，124.3（3×2）；仲碳信号39.9，39.8，28.5，27.0，26.8（5×2）；伯碳信号25.9，17.8，16.2，16.3（3 × 2）。以上数据与文献[15]角鲨烯数据一致。

4 抗氧化实验

4.1 溶液配制 用无水乙醇将DPPH自由基配制成2 × 10-3 mol·L-1溶液，置于4 ℃避光保存。将各样品化合物与阳性对照药分别用无水乙醇配制成0.01 mol·L-1溶液，测试前用无水乙醇稀释成所需浓度。

4.2 活性的测定方法 参照文献实验方法[16]并加以改进，将不同浓度的供试品溶液100 μL和2×10-4 mol·L-1 DPPH自由基溶液100 μL加入96孔板各孔中，选择常用抗氧化剂维生素C（Vit C）和2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）作为阳性对照，同时以不加DPPH自由基（以100 μL无水乙醇代替DPPH自由基）的供试品溶液各浓度作为对照以消除供试品本身颜色对测试结果的干扰，并设DPPH自由基阴性对照（以100 μL无水乙醇代替供试品），每组平行设3个复孔。将96孔板放入酶标仪中，振荡1 min，并于此条件下保存（室温、避光），30 min后测试其在517 nm处的吸光度A，按如下公式计算供试品的自由基清除率。

4.3 活性测试结果 自由基清除率公式：清除率=[ADPPH.control –（Asample– Asample.control）] / ADPPH.control × 100%。其中：ADPPH.control为DPPH自由基阴性对照组A的平均值；Asample为样品组A的平均值；Asample.control为样品乙醇对照组A平均值。计算IC50。

杜仲叶中化合物的DPPH自由基清除活性结果见表1，其中化合物2的活性表现出显著的抗氧化活性，活性强于Vit C，化合物 1，3，9显示中等抗氧化活性，弱于Vit C但强于BHT的活性，化合物4，6活性较弱。

5 讨论

杜仲是地质史上第三纪冰川运动残留下来的唯一一科一属的落叶乔木。在我国，杜仲主要分布于陕、甘、川三省交界的秦巴山区，为国家二级珍稀树种。传统上以杜仲皮入药，具有补肝肾，强筋骨，调血压，防衰老，抗肿瘤等功效，药用价值极高。然而，在资源考察中发现，杜仲采收仍以伐树剥皮为主，而从种树到剥皮一般需要15年以上，因此仅以皮作为药源势必引起资源紧缺。研究表明，杜仲叶与皮具有相似的化学成分和药理作用，且资源丰富，具有可再生的特点，因此，系统开展杜仲叶物质基础研究，可为杜仲叶替代杜仲皮药用提供理论依据。

骨质疏松症是老年人常见疾病，其发病率、致残率高，严重危害着人们的身体健康。研究发现活性氧可以增强破骨细胞的活性，减少成骨细胞的数量以及直接参与基质的降解，可能是导致骨质疏松症发生的诱因之一。中药中富含抗氧化成分，如黄酮、木脂素等多酚类物质，从中寻找活性成分，对于发掘新型抗骨质疏松药物具有重要意义。本研究结果发现，杜仲叶中黄酮类和木脂素类化学成分均表现出较强的抗氧化活性，为后期深入开展杜仲预防绝经后骨质疏松症药理作用的研究奠定了基础。

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Chemical constituents of leaf of Eucommia ulmoides

YANG Fang， YUE Zheng-gang， WANG Xin， ZHANG Xiu-peng， CHAI Jiang，

CUI Jiu-cheng， SONG Xiao-mei， MEI Qi-bing

（1.Shaanxi College of Traditional Chinese Medicine， Xianyang 712046， China；

2. School of Pharmacy， the Fourth Military Medical University， Xi′an 710032， China；

3. Collaborative Innovation Center for Chinese Medicine in Qinba Mountains， Xi′an 710032， China；

4. the First Hospital of Xi′an， Xi′an 710002， China）

[Abstract] Ten compounds were isolated from the leaf of Eucommia ulmoides by means of recrystallization and chromatographic techniques such as D-101 macroporous resin，MCI resin，ODS gel，Sephadex LH-20 and Rp-HPLC. Their structures were identified by NMR spectral analyses as kaempferide 3-O-β-D-glucoside（1），quercetin-3-O-β-D-glucoside（2），quercetin（3），quercetin-3-O-β-D-xylosyl-（12）-β-D-galactoside（4），kaempferol-3-O-α-L-rhamnosyl-（16）-β-D-glucoside（5），（2S，3S）-taxifolin 3-O-β-D-glucoside（6），4-hydroxy cinnamic acid（7），（+）-cycloolivil（8），pinoresinol β-D-glucoside（9），squalene（10）. Among them compounds 1，5-7，10 were isolated from the Eucommia genus for the first time. In the DPPH free radical scavenging assay，compound 2 exhibited significant activity（IC50 13.7 μmol·L-1），compared with vitamin C（IC50 59.9 μmol·L-1）； compounds 1，3 and 9 showed moderate activity（IC50 161，137， 214 μmol·L-1），compared with 2，6-di-tert-butyl-4-methylphenol（IC50 236 μmol·L-1）； compound 4 and 6 showed weak activity（IC50 264， 299 μmol·L-1）.

[Key words] Eucommia ulmoides； chemical constituents； flavonoids； lignans； antioxidant activity of DPPH free radical scavenging assay

doi：10.4268/cjcmm20140817