不同产地南五味子中木脂素分析研究

[摘要] 采用UPLC-TQ-MS技术对不同产地南五味子药材中的7种木脂素类成分进行分析评价，为南五味子的科学药用提供实验依据。结果显示秦岭以南，东侧的商洛市柞水县、山阳县所产南五味子中主要含五味子酯甲、五味子甲素;宝鸡市眉县，安康市石泉县、宁陕县，汉中市略阳县所产的南五味子主要含有安五酯素，其中宁陕县样品中五味子甲素含量也较高;而位于秦巴山区腹地的汉中市南郑县所产的南五味子主要含五味子酚、五味子甲素。总之不同产地的南五味子所含木脂素种类和含量差别很大，在实际应用中应结合现代药理实验和临床研究，根据所治疗疾病相关的主要功效成分对不同产地南五味子药材加以区别入药，以达到药物的最佳疗效。

[关键词] 南五味子;木脂素;LC-MS

[收稿日期] 2014-08-05

[基金项目] 国家自然科学基金面上项目（81373978）;陕西省重点科技创新新团队（2012KTC-20）

[通信作者] *唐志书，博士，教授，主要从事中药资源开发与综合利用研究，E-mail：

[作者简介] 杨洁，硕士研究生，Tel：18691017877，E-mail：

南五味子为木兰科植物华中五味子Schisandra sphenanthera Rehd. et Wils 的干燥成熟果实。始载于《神农本草经》，列为上品，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心等功效[1]。南五味子广泛分布于我国陕西、河南、安徽、湖北等地[2]。《唐本草》中记载有五味子“出蒲州及蓝田山中”，宋《图经本草》也记述，五味子“陕西州郡尤多”。秦岭山脉自古就是南五味子一大主产区，主要分布在安康、汉中、西安、渭南、太白山、眉县等地[3]。研究发现南五味子中含有大量的木脂素类成份，具有很好的降酶、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用[4]。如五味子酯类成分能显著降低谷丙转氨酶[5]，总木脂素部位具有镇静、催眠等多种药理作用[6]。南五味子为中医临床常用的重要收涩药，已有许多以南五味子为源药材的药物上市销售，如护肝片、五酯滴丸、五味子糖浆等。其临床应用十分广泛，而保证原药材的质量对临床疗效至关重要。已有学者研究产于秦岭东西南北的南五味子木脂素种类、含量差别很大[7-8]，但其选点较少，所测成分单一，不能较为全面的反映南五味子药材的品质。基于此，本文对多产地多批次的南五味子药材采用高效准确的UPLC-TQ-MS技术进行多成分分析，以期为南五味子药材的合理利用提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

Waters ACQUITY UPLC系统（Waters公司，Milford，USA）;Xevo TQ检测器（Waters公司）;MassLynx4.1质谱工作站软件（Waters公司）;ML204/MS105型电子天平（梅特勒-托利多公司）;DHG9240型鼓风干燥箱（杭州蓝天化验仪器厂）;EPED超纯水系统（南京易普达易科技发展有限公司）;KQ250E型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）;Anke GL-16GII型离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试药与试剂

对照品五味子乙素（批号110765-200710）、五味子甲素（批号 110764-201111）、安五脂素（批号111844-201102）、五味子酯甲（批号111529-200604），五味子醇甲（批号 110857-201211）购自中国食品药品检定研究院;对照品五味子酚（69363-14-0）、五味子丙素（61301-33-5）购自成都曼思特生物科技有限公司。以上对照品经HPLC-PDA检测纯度均大于98%;甲酸（Merck，德国）和乙腈（Tedia，美国）均为色谱纯，超纯水（自制），其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 样品的采集与加工方法

南五味子干燥样品收集自陕西9个地区，经南京中医药大学段金廒教授鉴定为木兰科植物华中五味子的干燥成熟果实。粉碎，过3号筛。样品信息见表1。

表1 南五味子产地信息

Table 1 Sample of Schisandra sphenantherae

样品编号产地

SSBB 1～SSBB 10商洛市山阳县板岩镇北沟寺村

SZYY 1～SZYY 10商洛市柞水县营盘镇药王堂村

HLBZ 1～HLBZ 10汉中市略阳县白水江镇张家坪村

HNHY 1～HNHY 10汉中市南郑县黄官镇庙坝村

ASCC 1～ASCC 10安康市石泉县长阳乡长阳村

ANGX 1～ANGX 5安康市宁陕县广货街镇蒿沟村

ANJJ 1～ANJJ 5安康市宁陕县江口镇江口村

BMTT 1～BMTT 5宝鸡市眉县汤峪镇铜峪村

BMYH 1～BMYH 5宝鸡市眉县营头镇红河村

2.2 含量测定方法

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为五味子甲素513 mg・L-1、五味子乙素203 mg・L-1、五味子酯甲103 mg・L-1、五味子酚126 mg・L-1、安五酯素387 mg・L-1、五味子丙素176 mg・L-1、五味子醇甲323 mg・L-1的对照品溶液。分别精密吸取上述各对照品溶液若干配制成浓度分别为73.3，29.0，14.7，18.0，55.3，25.1，46.1 mg・L-1的混合对照品储备液，4 ℃条件下贮藏备用。取混合对照品储备液适量，采用逐级稀释的方法，制成不同浓度的对照品应用液，各成分浓度系列见表2，供考察线性范围和含量测定用。

2.2.2 供试品溶液的制备 取各样品粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足失重，摇匀，取1 mL稀释至10 mL，经

表2 对照品应用液各成分浓度

Table 2 The concentration ranges of each reference substancemg・L-1

质量浓度五味子酯甲五味子醇甲五味子甲素五味子酚五味子乙素安五脂素五味子丙素

Cv114.746.173.318.029.0 55.325.1

Cv23.6811.518.34.507.2513.86.29

Cv30.9202.884.581.131.813.461.57

Cv40.2300.7211.150.2810.4530.8640.393

Cv50.057 50.1800.2860.070 30.1130.2160.098 2

Cv60.014 30.045 10.071 60.017 60.028 30.054 00.024 6

Cv70.003 590.011 30.017 90.004 390.007 080.013 50.006 14

Cv80.000 8980.002 820.004 470.001 100.001 770.003 370.001 53

0.22 μm的微孔滤膜滤过后，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 色谱分析条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～4 min，70%B;4～4.5 min，70%～90%B;4.5～5 min，90%B;5～6 min，90%～70%B）;流速0.3 mL・min-1;柱温35 ℃;进样体积5 μL。

2.2.4 质谱检测条件 离子化模式：ESI+;多反应监测（MRM）方式;毛细管电压3.0 kV;离子源温150 ℃;脱溶剂气温度550 ℃;脱溶剂气流量1 000 L・h-1;锥孔气流量50 L・h-1;碰撞气流量0.15 mL・min-1;各化合物的保留时间、取样锥孔电压及碰撞能量见表3。在上述色谱与质谱条件下所测各成分MRM 色谱图见图1。

3 结果

3.1 方法学研究

3.1.1 线性范围 将2.2.1项下制备的不同浓度混合对照品应用液，按2.2.3所述色谱条件分别进样2 μL，对照品浓度为横坐标，以峰面积的积分值为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表4。

3.1.2 精密度试验 取2.2.1项下制备的混合对照品储备液2 μL，按2.2.3所述色谱条件连续重复进样6次，测定峰面积的积分值。结果五味子酯甲、五味子醇甲、五味子甲素、五味子酚、五味子乙素、安五脂素、五味子丙素的RSD分别为2.2%， 1.3%， 0.98%， 2.0%， 1.1%， 3.2%， 1.8 %，表明仪器精密度良好。

表3 7种木脂素类成分的主要质谱检测参数

Table 3 MS parameters of seven investigated compounds

化合物m/ztR/minMRM监测离子锥孔电压/kV碰撞能量/eV

五味子酯甲536.571.92537.4 > 415.31812

五味子酚 402.482.26403.4 > 302.02626

安五脂素 328.412.71329.2 > 175.11214

五味子甲素416.513.14417.3 > 316.33224

五味子乙素400.463.80401.3 > 300.32828

五味子丙素384.424.29385.9 > 285.13022

五味子醇甲432.501.32433.3 > 384.32420

图1 南五味子中各成分MRM色谱图

Fig.1 MRM Chromatograms of seven compounds in Schisandra sphenantherae

3.1.3 稳定性试验 按2.2.2项下制备HNHY6样品的供试品溶液，分别在0， 3， 6， 9， 12， 24 h按2.2.3所述色谱条件进样。结果五味子酯甲、五味子醇甲、五味子甲素、五味子酚、五味子乙素、安五脂素、五味子丙素的RSD分别为1.8%， 0.93%， 0.30%， 0.55%， 0.81%， 2.4%， 1.1%，表明供试品溶液中上述5个成分在24 h内具有较好的稳定性。

3.1.4 重复性试验 精密称取6份HNHY6样品，按2.2.2项下制备供试品溶液，按2.2.3所述色谱条件下进样。结果五味子酯甲、五味子醇甲、五味子甲素、五味子酚、五味子乙素、安五脂素、五味子丙素的RSD分别为1.4%， 2.3%， 0.88%， 1.3%， 1.6%， 0.96%， 2.0%，表明本法重复性良好。

3.1.5 加样回收率试验 精密称取6份HNHY6样品，分别准确加入与样品中五味子酯甲、五味子醇甲、五味子甲素、五味子酚、五味子乙素、安五脂素、

表4 线性回归方程及LOD和LOQ测定

Table 4 Linear regression data and validation of developed method for seven investigated compounds in Schisandra sphenantherae

对照品回归方程R2线性范围/μg・L-1LOD/μg・L-1LOQ/μg・L-1

五味子醇甲Y=86 321X+95.4621.0000.002 8～0.721 00.11 0.35

五味子酯甲Y=8 737.9X+2 813.20.993 9 0.000 9～14.714 30.27 0.90

五味子酚 Y=105 150X+25 6580.998 9 0.017 6～18.000 00.27 0.92

安五脂素 Y=10 796X+5 240.90.999 6 0.054 0～55.285 70.51 1.69

五味子甲素Y=529 004X+570 2560.987 5 0.071 6～18.321 40.12 0.41

五味子乙素Y=44 963X+3 6110.999 8 0.001 8～1.812 50.04 0.15

五味子丙素Y=243 786X+2 416.80.999 6 0.001 5～1.571 40.14 0.47

五味子丙素质量相当的对照品溶液，按2.2.2项下制备供试品溶液，按2.2.3所述色谱条件下进样，计算加样回收率。结果五味子酯甲、五味子醇甲、五味子甲素、五味子酚、五味子乙素、安五脂素、五味子丙素的平均回收率（n=6）分别为100.4%， 98.61%， 99.89%， 102.1%， 99.67%， 97.58%， 100.6%，RSD分别为2.7%， 1.3%， 2.0%， 1.0%， 0.21%， 1.3%， 1.2%。

3.2 样品测定结果

按2.2.2项下制备各样品的供试品溶液，按2.2.3所述色谱条件下进样。测定峰面积，计算，样品含量按干燥品计算，见图2。

图2 南五味子样品中7种木质素成分含量

Fig.2 Determination results of the seven lignans in Schisandra sphenantherae

4 结果分析与讨论

为解释不同产地与南五味子各木脂素成分的相互关系，用SPSS 19.0统计软件对样品含量数据进行主成分分析，见表5，前2个主成分的特征值均大于1，说明前2个因子在反映产地与南五味子各木脂素成分的相互关系中起着主导作用，2个主成分的累积贡献率达93.99%，能够较客观地反映产地不同与木脂素成分的内在联系，故选取前2个主成分进行分析，各样品的主成分得分图见图3。五味子醇甲、五味子酚、五味子乙素和五味子丙素在PC1上有较高载荷，说明主要反映了五味子醇甲、五味子酚、五味子乙素和五味子丙素指标的信息;同理，PC2主要反映了五味子酯甲指标的信息，见表5。

相同产地的样品都能很好的聚集在一起，说明相同产地不同批次间的样品成分含量及种类无明显差异。9个采集地的70个样品根据主成份得分近似可分为3组。组1由汉中市南郑县样品组成，组2由商洛市柞水县、山阳县的样品组成，其余样品共同组成组3，见图3，可看出组间差异较大。

对样品含量数据进行ANOVA分析，发现组1和组2、组3的主要差异性成分为五味子酚，组1汉中市南郑县的样品中五味子酚平均含量为8.53 mg・g-1，远远高于组2的652 μg・g-1和组3的106 μg・g-1。组2和组1、组3的主要差异性成分是五味子酯甲，组2商洛市的样品中五味子酯甲含量平

图3 样品主成分的得分图

Fig.3 The scatter plots obtained by PCA of the samples

表5 主成分的特征值及贡献率

Table 5 The eigenvalues and total variance explained of the extracted components

主成分特征值方差贡献率/%累积方差贡献率/%

14.58865.54365.543

21.99128.44693.990

均为1.71 mg・g-1，而在组1、组3中平均含量仅为60.7，15.2 μg・g-1，远远低于组2。安五脂素是组3和组2、组1间的主要差异成分，其在组3中的含量平均为1.35 mg・g-1，约为其在组1中平均含量330 μg・g-1的4倍，在组2中平均含量590 μg・g-1的2倍。

组2的样品采集地商洛市柞水县、山阳县位于秦岭以南，秦岭东侧;组3的样品采集地大多位于秦岭西侧。有文献报道称根据华中五味子果实中木脂素成分的变异， 结合其地理分布，可将产自秦岭的华中五味子分为2种类型：产于秦岭以南、秦岭东侧、中条山及太行山南端的华中五味子果实主要含有五味子酯甲;产于秦岭西侧陕西太白山、留坝、甘肃小陇山的华中五味子果实主要含有安五脂素[4]。本文的实验结果与上述报道相一致。

在所测的70批样品中，仅产自商洛市的20批样品（SZYY1（10，SSBB1（10）符合药典标准，安康市宁陕县样品中的五味子酯甲平均质量分数仅有43.3 μg・g-1，而安康市石泉县样品中的平均质量分数更低至0.95 μg・g-1，与黄梅芬报道的秦岭南侧安康地区不含降低血清中谷丙转氨酶的有效成分

表6 南五味子中7个木脂素成分的相关矩阵

Table 6 Correlation Matrix of the seven lignans in Schisandra sphenantherae

主成份五味子酯甲五味子醇甲五味子甲素五味子酚五味子乙素安五脂素五味子丙素

10.3050.9290.7260.8880.895-0.8540.886

20.9450.270.592-0.451-0.438-0.266-0.457

五味子酯甲、乙、丙、丁相一致。

汉中市南郑县的样品中含有大量的五味子酚尚未见报道，五味子酚是一种联苯环辛烯型木脂素，存在于多种五味子科植物中。现代药理实验证明五味子酚具有抗凝纤溶、抗血小板聚集和扩血管活性， 对脑梗死及再灌注损伤在大脑功能和形态学方面均具有治疗保护作用， 是一个治疗缺血性脑中风的潜在药物[9]。南郑县的样品可作为以五味子酚为主要药效物质药物的原药材。

5 结语

总之，本研究采用高效准确的UPLC-TQ-MS技术，对不同产地的南五味子中的木脂素类成分进行了质量检测分析，不同产地的木脂素类成分质量分数有明显的差异。南五味子作为药用植物，在用药时，应根据不同药用成分合理利用，才能更好的控制药品的质量;才能更为科学合理的开发南五味子的药用资源。

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Determination of lignans in Schisandrae Sphenantherae

Fructus from different regions

YANG Jie1，2， DUAN Jin-ao 1，2， LI Guo-long1， ZHU Zhen-hua1， ZHU Tai-lei1 ， QIAN Da-wei1，2， TANG Zhi-shu1*

（1.Shaanxi University of Chinese Traditional medicine Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources

Industrialization/Shaanxi Key Laboratory of Chinese Pharmaceuticals and Drug Innovation Xianyang 712046， China;

2. Nanjing University of Chinese Medicine Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources

Industrialization， and National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources

Industrialization and Formulae Innovative Medicine， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China）

[Abstract] With an objective to provide an experimental basis for scientific officinal of Schisandrae Sphenantherae Fructus， this research uses UPLC-TQ/MS method to analyze 7 different kinds of lignan in 70 batches of Schisandra sphenantherae Fructus samples from 9 regions.The results showed that in the area south of Qinling mountains， Schisandrae sphenantherae Fructus from Zhashui county and Shanyang county of Shangluo mainly contained schisantherin A and deoxyschizandrin.However， Schisandrae sphenantherae Fructus from Mei county of Baoji， Shiquan county and Ningshan county of Ankang， and Lueyang county of Hanzhong， mainly contained anwuligan. Samples from Ningshan county also consists relatively high level of deoxyschizandrin.In the central area of Qinling mountains and the Daba mountains， Schisandrae Sphenantherae Fructus from Nanzheng county of Hanzhong mainly contained schisanhenol and deoxyschizandrin.In conclusion， the kinds and level of lignan differ significantly in Schisandrae sphenantherae Fructus produced in different regions. In practical application， Schisandrae Sphenantherae Fructus produced in different regions should be distinguished and differently applied based on their main effective components corresponding to different diseases， which can lead to the best clinical use.

[Key words] Schisandrae Sphenantherae Fructus; lignin; LC-MS

doi：10.4268/cjcmm20142332