来氟米特对糖尿病肾病大鼠肾脏VEGF表达的影响

[摘要] 目的:研究氟米特对糖尿病肾病大鼠肾脏血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:将48只清洁级雄性Wistar 大鼠随机分为正常对照组(A组)、模型对照组(B组)、来氟米特组(C组)和氯沙坦组(D组)。分别于糖尿病成模后8、12周处死,观察24 h尿蛋白排泄量、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、肾脏病理组织学改变、免疫荧光检测肾组织VEGF蛋白的表达,RT-PCR方法检测肾组织VEGF mRNA表达。结果:8、12周末糖尿病模型大鼠(B、C、D组)的Scr、BUN及 24 h尿蛋白较正常对照组(A组)均有显著增高(P

[关键词] 来氟米特;糖尿病肾病;血管内皮生长因子;氯沙坦

[中图分类号] R587.2 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721(2010)05(a)-018-04

Leflunomide on diabetic nephropathy VEGF expression in rat kidney

ZHAO Dongjia,YU Weimin,LI Rongshan

(Department of Nephrology,the Second Clinical Hospital of Shanxi Medical University, Shanxi Kidney Institute, Shanxi Province ,Taiyuan 030001,China)

[Abstract] Objective: To study the fluoride mitter of diabetic nephropathy rat kidney VEGF expression. Methods: Forty-eight male Wistar rats of clean grade were randomly divided into normal control group (A group), model control group (B group), leflunomide group (C group) and losartan group (D group). Diabetes into the mold, respectively, after 8 weeks, 12 weeks were observed at 24 h urinary protein excretion, blood urea nitrogen (BUN), creatinine (Scr), renal histopathological changes in renal tissue immunofluorescence detection of VEGF protein expression, RT-PCR used to detect VEGF mRNA expression in kidney tissue. Results: 8 weeks, 12 week diabetic rats (B, C, D groups) Scr, BUN, and 24 h urinary protein compared with normal control group (A group) were significantly higher (P

[Key words] Leflunomide; Diabetic nephropathy;VEGF; Losartan

糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见的并发症,也是导致终末期肾脏衰竭的主要原因之一[1]。DN发生的机制复杂,研究表明DN时存在血管内皮生长因子(VEGF)表达增加,与早期DN的肾肥大和微量蛋白尿有关[2-3]。临床DN用药证实来氟米特确有能降低患者大量蛋白尿的作用,可以减轻肾脏病变程度及延缓DN向终末期进展[4],而来氟米特是否通过调节VEGF表达而发挥作用尚无报道。本实验拟制备实验性糖尿病大鼠模型,观察糖尿病大鼠肾损害情况和VEGF的表达以及来氟米特对其可能的保护机制。

1材料与方法

1.1实验材料

健康雄性Wistar大鼠48只,体重220～280 g,购于山西医科大学实验动物中心,链脲佐菌素(STZ,Sigma 公司),柠檬酸盐(上海生化试剂二厂),水合氯醛(上海生化试剂二厂),兔抗大鼠 VEGF多克隆抗体;即用型 SABC免疫组化染色试剂盒(武汉博士德工程有限公司),FITC-山羊抗兔IgG(美国SANTA CRUZ公司),来氟米特(苏州长征-欣凯制药有限公司)。

1.2实验分组及动物模型制备

按随机数字表法将48只大鼠分为4组,适应性饲养1周后,用10%的水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉,术前禁食12 h,开腹分离并摘除右肾。术后2周模型组与药物干预组给予STZ(50 mg/kg)腹腔注射,正常对照组腹腔注入等量柠檬酸缓冲液。72 h后断尾法测空腹血糖,空腹血糖≥16.7 mmol/L并稳定5 d即确定为成功的糖尿病模型,将成模糖尿病大鼠随机分成3组:模型对照组(B组)、来氟米特组(C组)和氯沙坦组(D组)。来氟米特干预组按5 mg/(kg・d) 灌胃给药,氯沙坦干预组用氯沙坦按20 mg/(kg・d)灌胃给药,正常对照组和模型对照组大鼠用等量蒸馏水灌胃。整个观察过程中糖尿病大鼠避免使用胰岛素及口服降糖药物。所有动物自由饮水进食。室温 18～20℃,相对湿度 60 %,12 h光照周期,共喂养12周。

1.3标本收集与肾脏病理学检查

于8、12周末,收集大鼠24 h尿液,检测尿蛋白定量,称大鼠体重,心脏采血行肌酐、尿素氮检测。取血后,解剖所有实验大鼠,分离左肾,去包膜,称重。将左肾沿纵向切开,一半放入10%甲醛溶液固定,石蜡包埋,常规切片,行PAS染色,光镜观察肾组织的病理变化。

1.4免疫荧光检测肾组织VEGF蛋白的表达

切片经过常规脱蜡、水化、组织抗原修复后,滴加5%BSA封闭液,室温 20 min后滴加兔抗大鼠 VEGF多克隆抗体,室温孵育60 min,PBS液冲洗;滴加山羊抗兔IgG-FITC荧光二抗(1∶200) 37℃避光孵育1 h,PBS冲洗5 min×3次震摇;中性树胶封片;全自动多功能荧光显微镜观察阳性染色发绿色荧光。每张切片随机选 30个视野,用全自动图像分析系统(Iage2 roplus 6.0)分别计数其ID值,取其平均值。

1.5 肾组织VEGF mRNA表达的检测

取另一半左侧肾脏皮质区 100 mg组织作总RNA 提取,按照 RNAROSE REAGENT说明书步骤提取肾皮质总 RNA,参照 PrimeScript, RT-PCR Kit说明书进行逆转录。PCR反应条件为: 94℃变性5 min;94℃ 60 s,58℃ 60 s,72℃ 60 s 共 38 个循环,72℃延伸10 min。引物根据文献[4],由大连宝森公司设计合成,引物序列分别为,VEGF,上游: 5′-ACTGGACCCTGGCTTTACTGC-3′,下游:5′-TTGGTGAGGTTTGATCCGCATG-3′;产物200 kb;β-actin,上游: 5′CTCT GGTCGTACCACTGGCATTG-3′,下游:5′-CCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3′,产物626 kb 。取5 μl扩增产物用20 g/L琼脂糖凝胶进行电泳图像分析系统分析各条带积分光密度值(OD),每组标本重复监测4次,以(VEGF/β-actin)×100 为VEGF mRNA 的相对值。

1.6统计学方法

所有数据均以x±s表示,组间比较采用单因素方差分析,由 SPSS 13.0统计分析软件完成,以P

2结果

2.1一般情况观察

正常对照组大鼠基本情况良好,体重增加明显,同时精神状态良好,活动自如。36只Wistar大鼠一次性注射足量STZ后全部成模,成模大鼠多有精神萎靡症状,均出现多饮、多食、多尿、消瘦、毛发枯黄无光泽等糖尿病表现。

2.2各组大鼠8周及12周末Scr、BUN及 24 h尿蛋白的测定

8、12周末糖尿病模型大鼠(B、C、D组)的Scr、BUN及 24 h尿蛋白较正常对照组(A组)均有显著增高(P

2.3大鼠肾脏病理组织学比较

12周末时PAS 染色见正常对照组大鼠肾小球囊腔内无渗出,肾小管结构清晰无管型;糖尿病模型组大鼠肾小球系膜区基质增多,系膜区明显扩宽,部分毛细血管塌陷,可见部分肾小管上皮细胞空泡变性、萎缩、坏死;来氟米特干预组及氯沙坦干预组上述病理改变较糖尿病模型组均有明显改善,见图1。

2.4大鼠肾皮质 VEGF蛋白表达的影响

实验结束后,每组随机不重复各取30个肾小球,测定面积密度(阳性面积/肾小球面积), 图像用高清晰度彩色病理图文分析系统进行分析,免疫荧光结果显示:正常组肾组织中VEGF有少量表达;DN模型大鼠肾组织中表达明显上调;来氟米特及氯沙坦干预组VEGF表达均下调,但来氟米特与氯沙坦干预组与糖尿病模型组相比VEGF阳性细胞数显著减少,与模型组相比差异均有统计学意义。各组12周末大鼠肾组织VEGF的病理表达见图2、3。

2.5大鼠肾脏VEGF mRNA 表达的影响

正常组肾脏组织 VEGF mRNA 表达极低,糖尿病模型组、来氟米特干预组及氯沙坦干预组大鼠肾脏组织VEGF mRNA 的表达均增高。来氟米特干预组与氯沙坦干预组与糖尿病模型组比较,VEGF mRNA 的表达显著降低(P

3讨论

DN是常见的糖尿病慢性微血管并发症之一 ,通常指由于糖尿病引起的肾小球基底膜增厚,系膜扩张以及胞外基质增生,导致肾小球的高滤过和蛋白尿[5],早期表现为尿中排出微量清蛋白,继之出现临床蛋白尿,最后进展为慢性肾衰竭。

DN的发生、发展与血管内皮功能障碍密切相关。血管内皮生长因子(vascular endothelial grow th factor , VEGF)是一种内皮细胞特异性的丝裂原,已发现 VEGF与DN 发生发展相关[6-7]。大量研究表明糖尿病肾病早期表现为:肾小球高滤过、肾小球和肾脏增大,随后系膜基质进行性扩张、肾小球和肾小管基底膜增厚、晚期肾小球硬化、肾间质纤维化、肾衰竭很大程度上与内皮功能障碍和血管病变相关[8]。VEGF作用于肾小球毛细血管内皮细胞,促进血管生长,增加血管通透性,参与DN早期蛋白尿的形成, 促进内皮细胞增生和单核细胞迁移,增加黏附分子及细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的产生,导致肾小球肥大、肾小球系膜区ECM堆积及肾小球硬化[8-10]。Flyvbjerg研究表明,长期应用VEGF抗体的2型DM大鼠,其肾脏功能得以改善,VEGF抗体治疗组在肾脏重量增加、肾小球容积增大、基底膜增厚、尿蛋白排泄增加均比安慰剂治疗组下降。由于VEGF增加血管通透性,故致某些细胞因子渗出,局部作用于肾小球系膜区,可刺激肾脏肥大,最终造成肾脏损害。本实验糖尿病大鼠有早期DN表现,且血糖、24 h 尿蛋白明显升高,证实糖尿病大鼠模型成功。本实验发现DN大鼠肾脏VEGF mRNA呈持续表达,VEGF 蛋白主要分布于肾小球上皮细胞,与既往报道一致[11]。本研究还发现在糖尿病模型组VEGF 分布范围较正常大鼠组明显增大,8、12 周在肾小管的表达明显增强。均说明VEGF在DN发生发展过程中可能起到一定的致病作用。

来氟米特是一个具有抗增殖活性的异恶唑类免疫抑制剂,口服吸收后在肠壁或肝脏内转化为其活性代谢产物A771726,通过A771726在体内抑制体液及细胞介导的免疫作用,具有抗炎作用[12-13]。现临床上已广泛用于狼疮性肾炎,难治性肾病综合征等治疗,取得较好的疗效。付宇等[14]对DN大量蛋白尿患者给予来氟米特治疗取得较好的疗效,表明来氟米特对糖尿病大鼠肾脏有保护作用。本研究发现来氟米特干预组较未治疗的DM大鼠24 h尿蛋白排泄减少,BUN、Scr水平下降;肾小球体积肥大减轻,系膜基质及系膜细胞明显减少,肾小管扩张程度及上皮细胞水肿明显改善,这些均提示LEF可以减少尿蛋白排泄, 减轻高血糖所致的肾脏改变。通过免疫组化笔者发现LEF组肾小球VEGF表达量均高于D组,从而得出LEF通过调节VEGF的表达量,延缓或抑制肾脏的损伤,从而在一定程度上发挥减轻蛋白尿,延缓DN进展的作用。RT-PCR方法也证实来氟米特组VEGF mRNA表达较糖尿病模型组减少。同时发现,与经典药物氯沙坦相比,来氟米特干预组各项指标差异无明显统计学意义,故也可证明来氟米特可能具有减少尿蛋白、保护肾脏结构与功能的作用。其机制值得进一步研究。

总之,VEGF在DN的发生及发展中起到一定的致病作用。本研究结果证实来氟米特对DN模型的VEGF表达具有一定的调节作用,可以减轻肾脏病变程度及延缓DN向终末期进展,但其具体作用机制有待于进一步研究。

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(收稿日期:2010-03-30)