抗氧化剂保护少弱离心过程氧化应激损伤的实验研究

【摘要】目的：探讨抗氧化剂谷胱甘肽、左卡尼汀对少弱体外离心过程中抗氧化应激损伤的作用。方法：按WHO标准选取38份少弱样本，每份样本各取1350μL，分为对照组、谷胱甘肽组和左卡尼汀组，各450μL。对照组仅加入EBSS平衡液，谷胱甘肽组加入含有一定水平谷胱甘肽的EBSS平衡液，左卡尼汀组加入左卡尼汀的EBSS平衡液，检测三组活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）及DNA断裂指数（DFI）并进行比较、分析。结果：三组组间比较均有统计学意义（F活性氧=9.45、P=0.000；F丙二醛=15.79，P=0.000；FDFI=13.56，P=0.000，P均

【关键词】左卡尼汀；谷胱甘肽；离心；氧化应激；少弱症

【中图分类号】R167【文献标志码】A

活性氧对的氧化应激损伤已被证实为男性不育的重要原因，而在辅助生殖技术 （ART）助孕过程中，处理患者的离心过程会引发活性氧过量产生，另外抗氧化化学物在处理过程严重丢失，更容易过氧化而损伤＼[1，2＼]。基于此，想方设法减少活性氧在处理过程的产生，对患者ART助孕的成功率，尤其对少弱症患者有重要意义。近几年，左卡尼汀、谷胱甘肽等抗氧化剂应用于男性不育的体内临床治疗研究比较广泛＼[3，4＼]，本研究旨在通过在离心过程中加入左卡尼汀、谷胱甘肽等抗氧化剂，经过生化检测分析处理后与对照组的活性氧（ROS）、丙二醛（ MDA）的浓度变化，探讨抗氧化剂在体外离心程序中减少氧化应激的功能。

1材料与方法

1. 1材料来源

2012年11月1日至2013年1月31日，我院生殖医学研究中心拟ART助孕的少弱标本共38份，供精者年龄25～35岁，已婚未育。男方要求身体健康，无吸烟、酗酒和长期接触有害物质史，无生殖道感染和精索静脉曲张史，无外伤及遗传性疾病史，无障碍史等。体检显示一般情况好，全身及男性生殖系统检查未见异常。术前常规检查按照WHO（人类检查与处理实验室手册》（2011年，第五版）标准＼[5＼]，排除液化不良及严重少弱精症，过氧化物酶染色法排除白细胞症。

1.2分组与处理

样本处理及检测在广西生殖医学研究中心实验室及广西医科大学实验中心进行。

每份患者样本首先置于37℃温箱液化20min，均匀混合后吸取3份，每份450μL，分为对照组、谷胱甘肽组和左卡尼汀组。谷胱甘肽组样本加入含5mmol/ L谷胱甘肽的EBSS溶液50μL，左卡尼汀组添加50μL含8mmol/L左卡尼汀的EBSS溶液，对照组仅加入等量的EBSS溶液，所有标本放入37℃温箱孵育20min后再放入离心机，以转速1200r/min进行离心10min待检。

1. 3丙二醛（MDA）的检测

通过使用硫代巴比妥酸（TBA）比色法进行MDA检测。选用南京建成生物制剂公司的MDA检测试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作，用分光光度计读取吸光度值。

1.4活性氧的检测

选用上海杰美生物制剂公司的细胞活性氧化学发光检测试剂盒，按照试剂盒说明书操作。

1.5DNA碎片检测

DNA的损伤情况使用染色质扩散法SCD方法进行测定[6]：先将1%低熔点琼脂糖加热液化，然后置于37℃保持液态，充分混合悬液与液态低熔点琼脂糖后，放置于铺了标准琼脂糖凝胶的玻片上，加盖片，置于4℃冰箱使低熔点琼脂糖凝固，拿走盖片后先后使用0.08mol /L HCl和碱性细胞裂解液处理，接着梯度乙醇脱水，Diff-Quik试剂盒染色，光学显微镜检测。由晕轮宽度与头部横径的比值，分为大、中、小和无光晕4个等级，DNA完整的产生扩散的大晕轮或中晕轮，而DNA损伤的不产生或产生很小的晕轮。DNA断裂指数（DFI）=（小晕轮数+无晕轮数）/总数。（附：a、大晕轮：晕轮宽度大于头部横径的2/3；b、中晕轮：晕轮宽度与头部横径之比在1/3～2/3之间；c、小晕轮：晕轮宽度小于头部横径的1/3；d、无晕轮：晕轮宽度与头部横径之比为0。）

1.6统计方法

所有数据资料均用均数±标准差（±s）表示，采用SPSS16.0统计软件进行分析。对照组、谷胱甘肽组和左卡尼汀组活性氧含量（ROS）、丙二醛含量（MDA）及DNA断裂指数（DFI）均用随机区组设计定量资料的方差分析法计算组间差异是否有统计学意义并进行两两比较，P

2结果

运用随机区组设计定量资料的方差分析处理数据资料（经检验，定量资料满足参数检验的前提条件），结果如下（详见表1）：（1）处理组间：F活性氧=9.45、P=0.000；F丙二醛=15.79，P=0.000，FDFI=13.56，P=0.000，组间差异均有统计学意义；（2）用LSD法对处理组间进行两两比较：a.谷胱甘肽组、左卡尼汀组与对照组ROS的比较， P=0.001、0.000，差异有统计学意义；谷胱甘肽组与左卡尼汀离心组间ROS的比较， P=0.570，差异无统计学意义。b.谷胱甘肽组、左卡尼汀组与对照组MDA的比较，P=0.000、0.000，差异有统计学意义；谷胱甘肽组与左卡尼汀离心组间MDA的比较，P=0.181，差异无统计学意义。c.谷胱甘肽组、左卡尼汀组与对照组DFI的比较，P=0.000、0.000，差异有统计学意义；谷胱甘肽组与左卡尼汀离心组间DFI的比较，P=0.270，差异无统计学意义。

3讨论

过量的ROS引起的氧化应激损伤在男性不育病因上占很大的作用＼[7＼]。氧化应激造成的膜损伤和DNA断裂，可诱发功能障碍和形态异常，并最终导致男性不育，或导致子代异常[8]。研究表明，抗氧化剂治疗对降低氧化应激有重要意义＼[9＼]。降低氧化应激的抗氧化治疗是的重要保护形式，具有抗氧化应激作用的药物，如左卡尼汀、辅酶Q10、谷胱甘肽、番茄红素等，已广泛用于男性不育的治疗的各环节＼[10，11＼]。

辅助生殖技术已成为治疗少、活力低下、畸形等引起的男性不孕的重要的补充手段。而在其必不可少的优选环节，广泛应用的梯度离心处理方法打破了中存在的多种抗氧化机制平衡，产生过量的活性氧。而过量活性氧可以使膜脂质过氧化损伤，产生大量脂类过氧化物，特别是醛式产物（如丙二醛等）影响膜的流动性，甚者引起高频率的单股和双股DNA断裂[12]等。因此对离心过程中的提供抗氧化保护是很有必要的。而在离心处理中补充抗氧化剂以减少ROS诱导损伤是建议的一种方式。本研究旨在检查其它抗氧化剂如左卡尼汀和谷胱甘肽降低活性氧、脂质过氧化物产生以及减少DNA损伤等影响。

我们发现将抗氧化剂左卡尼汀、谷胱甘肽用于少弱症离心处理中，通过化学发光法对活性氧及硫代巴比妥酸（T BA）比色法检测丙二醛与对照组的数据统计分析，证实了这两种抗氧化剂可显著降低离心处理的活性氧、脂质过氧化水平，起到显著抗氧化保护作用。这与唐光昕＼[13＼]及Yenilmez E等＼[14＼]的研究结果一致。

有研究表明，少弱精症患者精浆的左卡尼汀水平与活率、密度及DNA完整性等有正相关关系＼[15＼]。在启动运动、促进成熟、调节支持细胞功能、减少生精细胞凋亡等方面，左卡尼汀均有重要用途，此外，因其具有清除组织内ROS的抗氧化性能而对氧化应激损伤拥有保护功效＼[16＼]。保护细胞免遭氧化损伤，减少细胞DNA结构的损伤[17]，国内外相关的临床试验也客观证实了补充左卡尼汀对少弱症的疗效＼[18，19＼]。

谷胱甘肽（GSH）广泛存在于有机体中，它是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸以肽键形式缩合而成的一种化合物。是谷胱甘肽转移酶和谷胱甘肽还原酶的作用产物，通过谷胱肽氧化酶催化H2O2，反应生成H2O，与此同时将脂质过氧化物催化反应生成生成相应的醇，故而清除体内过多的H2O2，防止蛋白质的变性，减少自由基对DNA分子的损伤，减少DNA分子突变＼[20＼]。体外实验中，有研究表明GSH不仅对ROS引起的DNA损伤有保护作用，而且对活化的多形核白细胞引起的活力的降低也有作用。

研究同时发现，添加抗氧化剂左卡尼汀、谷胱甘肽用于少弱症离心处理中，用染色质扩散法SCD方法检测DNA碎片指数，与对照组比较显示添加抗氧化剂对降低DNA碎片率有益。这与H.J. Chi1等＼[21＼]研究结果即抗氧化剂乙二胺四乙酸和过氧化氢酶都能显著降低DN段化率一致，但该研究同时显示抗氧化剂没有减少脂质过氧化作用。而Donnelly ET等＼[22＼]研究结果则显示添加谷胱甘肽或/和亚牛磺酸的样本在制备中对DNA完整性没有显著效果，与本研究结果不一致。原因可能是由于条件有限本实验只选择了少弱症的小样本进行研究，由于少弱症样本量小，实验相关检测项目不能全部开展，尚不知道这些添加剂在精浆中的最佳浓度以及多种抗氧化药物联合应用效果；本研究进行了ROS、MDA以及DNA碎片率和活性的检测，其具体效果尚需更进一步的研究和更大样本量的实验来验证。

总之，制备含有合适浓度的抗氧化剂离心处理精浆，对降低活性氧水平从而提高总体功能是有作用的，应进一步研究相关抗氧化剂选择以便提高辅助生殖技术助孕的成功率，减少流产率等。

参考文献

＼[1＼]Aitken RJ， De Iuliis GN， Finnie JM， et al. Analysis of the relationships between oxidative stress， DNA damage and sperm vitality in a patient population： development of diagnostic criteria. Hum Reprod 2010，25（10）：2415-2426 .

＼[2＼]Aitken RJ， Hanson AR， Kuczera L.Electrophoretic sperm isolation： optimization of electrophoresis conditions and impact on oxidative stress. Hum Reprod. 2011，26（8）：1955-1964.

＼[3＼]李铮， 陈国武， 商学军， 等. 左旋肉碱和乙酰左旋肉碱合用治疗少弱症有效性与安全性的多中心随机对照临床研究.中华男科学杂志， 2005， 11（ 10）： 761-764.

＼[3＼]DokmeciD，InanM，Basaran UN，et al. Protective effect of L-carnitine on testicular ischaemia-reperfusion injury in rats.Cell Biochem Funct，2007（25）：611-618.

＼[4＼]吴正沐， 陆湘， 王永卫，等.短期应用左卡尼汀在卵细胞胞质内单注射治疗少弱症中的作用.中华男科学杂志，2012，18（3）：253-256.

＼[5＼]谷翊群，陈振文，卢文红，等.世界卫生组织人类检查与处理实验室手册.北京：人民卫生出版社，2011：191-194.

＼[6＼]Fernandez JL，Mouriel L，Rivero MT，et al. The sperm chromatin dispersion test： a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation.J Androl，2003，24（1）：59-66.

＼[7＼]Aitken RJ，Baker MA，et a1. New insights into sperm physiology and pathology.Handb Exp Pharmacol. 2010（198）：99-11.

＼[8＼]Agarwal A，Makker K，Sharma R.Clinical relevance of oxidative stress in male factor infertility：an update.Am J Reprod Immunol，2008（59）：2-11.

＼[9＼]Kathleen H， Dolores J， et al. Molecular Mechanisms of Antioxidants in Male Infertility.Male Infertility. 2012， 45-54.

＼[10＼]DokmeciD，InanM，Basaran UN，et al. Protective effect of L-carnitine on testicular ischaemia-reperfusion injury in rats.Cell Biochem Funct，2007（25）：611-618.

＼[11＼]The role of sperm oxidative stress in male infertility and the significance of oral antioxidant therapy. Hum Reprod. 2011 ，26 （7）：1628-1640.

＼[12＼]Shamsi MB，Kumar R，Dada R. Evaluation of nuclear DNA damage in human spermatozoa in men opting for assisted reproduction.Indian J Med Res，2008，127（2）：115-123.

＼[13＼]唐光昕， 王新生， 王世平，等.左卡尼汀对少弱离心过程中的保护作用.齐鲁医学杂志，2011，26（5）：459-462.

＼[14＼]Yenilmez E，Yulug E， Aydin S，et al. Ham’s F-10 medium and Ham’s F-10 medium plus vitamin E have protective effect against oxidative stress in human semen. Urology，2006（67）：384-387.

＼[15＼]商学军，王修来.肉碱在男科临床治疗中的研究进展. 中华男科学杂志， 2006， 12（ 9）：826-831.

＼[16＼]Allamanenis S，Agarwal A，Nallellak P， et al .Characterization of oxidative stress status spermatozoa .Fertil Steril， 2005， 83（ 7）： 800-803.

＼[17＼]Bucak MN，Tuncer PB，Sarzkan S，et al.Effects of antioxidants on post-thawed bovine sperm and oxidative stress parameters：Antioxidants protect DNA integrity against cryodamage. Cryobiology，2010，61（3）： 248-253.

＼[18＼]Balercia G， Regoli F， Armeni T， et al.Placebo-controlled double-blind randomized trial on the use of L-carnitine， L-acetylcarnitine， or combined L-carnitine and L-acetylcarnitine in men with idiopathic asthenozoospermia. Fertil Steril ， 2005， 84（ 3）：662-671.

＼[19＼]吴正沐，陆湘，王永卫，等.短期应用左卡尼汀在卵细胞胞质内单注射治疗少弱症中的作用. 中华男科学杂志， 2012，18（ 3）： 253 - 256.

＼[20＼]Generoso WM，Cain KT，Krishna M，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1979，76（1）：435-437.

＼[21＼]Chi HJ，Kim JH，Ryu CS，et al.Protective effect of antioxidant supplementation in sperm-preparation medium against oxidative stress in human spermatozoa.Hum Reprod，2008，23（5）：1023-1028.

＼[22＼]Donnelly ET， McClure N， Lewis SE. Glutathione and hypotaurine in vitro： effects on human sperm motility， DNA integrity and production of reactive oxygen species.Mutagenesis，2000（15）：61-68.

（收稿日期：2013-08-29）