基因芯片技术在昆虫抗药性研究中的应用

摘要：化学杀虫剂滥用导致昆虫抗药性问题日渐突出，研究昆虫抗药性是为了更有效地防治害虫。基因芯片为害虫抗药性研究提供了理想的平台。综述了基因芯片技术在昆虫抗药性研究中的应用进展，重点总结了细胞色素P450氧化酶、酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶等解毒酶基因和乙酰胆碱酯酶等靶标酶基因的表达情况，为在分子水平上研究昆虫抗药性提供了依据，为从基因组学水平深入、全面开展昆虫与农药的互作研究奠定了基础。

关键词：基因芯片；昆虫抗药性；解毒酶基因；靶标基因

中图分类号：S481+.4；S433；Q811.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）14-3335-06

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2015.14.002

Application of Microarray Technology on Insect Resistance Research

WU Hua-Jun，LUO Lin-Lin，LIN Tong

（College of Forestry， South China Agricultural University， Guangzhou 510642，China）

Abstract： Abuse of chemical pesticides leads to the problem of insect resistance， which has become increasingly prominent. The objective of study on insect resistance is to control insect pests more effectively. The progress of application of microarray technology on insect resistance research， especially the expression of the genes encoding cytochrome P450 monoxygneases， estaesres， glutathione-S-transferases and acetylcholinestcrase were reviewed in this paper to provide the references for study on insect resistance at the molecular level and lay the foundation for comprehensive interaction research between insects and pesticides from the genomics level in-depth.

Key words： microarray； insect resistance； detoxifying enzyme gene； targe site gene

化学杀虫剂在人类近几十年的农业生产中扮演着重要角色，特别是在虫害综合治理方面起到了重要作用。但杀虫剂的大量持续性使用导致了昆虫抗药性的发生和发展，世界卫生组织（WHO）对昆虫抗药性的定义为：“形成具有耐受杀死正常种群大部分个体的药量的能力。”昆虫已对有机磷类、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类等杀虫剂均产生了抗药性[1]。据报道，截至2007年至少有543种昆虫对杀虫剂产生了抗药性[2]。昆虫日益增强的抗药性造成了农作物的大量减产和害虫的再猖狂，农药的不合理使用甚至加剧了人类各种疾病的蔓延和环境污染，造成经济社会的重大损失。研究昆虫产生抗药性的机理对防止和延缓昆虫抗药性至关重要。确定昆虫抗性的产生、发展及抗性水平是提高害虫防治效果的关键。传统的抗药性检测方法由于存在费时、耗力、所需样虫数量大等不足，很难适应抗药性治理的需要[3]。近年来，基因芯片的出现和应用为害虫抗药性研究提供了理想的研究平台。

基因芯片技术是 20世纪 90年展起来的分子生物学技术，是各学科交叉综合发展的产物。1995年第一块基因微矩阵芯片在斯坦福大学诞生，并首先被应用于人类基因组的研究[4]。1996年世界上第一块商业化的基因芯片研制成功[5]。中国基因芯片产业从20世纪末起步，并已涉及到多个应用领域，主要产品包括基因表达谱芯片、有害生物监测芯片、转基因农产品检测芯片和人类病毒基因检测芯片[6]。同时，基因芯片在测量基因组大量基因表达水平上有着优异的表现，已经在许多不同的生物体上得到运用，包括酵母、线虫、人类、白鼠、果蝇和植物上[7-12]。基因芯片相比于传统的研究方法更快捷、高效地对昆虫抗药性的产生、发展机制做出检测，有助于人们从分子水平上去研究昆虫抗药性。

本文综合了国内外用基因芯片平台研究害虫抗药性的研究成果，综述了由基因芯片检测到的抗药性基因的表达变化情况和与此相关的昆虫抗药性产生及发展的分子机制，为在分子水平上研究昆虫抗药性提供依据，为从基因组学水平深入、全面开展昆虫与农药的互作研究奠定基础。

1 基因芯片概述

1.1 原理及特点

基因芯片原理是把核酸片段作为识别分子，按预先设置的排列固定于载体的表面形成微点阵，利用反向固相杂交技术，将标记的样品分子与微点阵上的核酸探针杂交，以实现多达数万个分子之间的杂交反应，并利用特定的检测系统来高通量、大规模地分析检测样品定基因分子的存在或者多个基因的表达状况[13]。基因芯片最显著的特点是高通量、高度并行性、高灵敏度[14]。

1.2 制作方法

用于构建基因芯片有多种方法，一类是点样法，即直接将大量合成好的探针通过机器人有序地点印在芯片表面。用这种方法，cDNA微阵列能在基板上点上万个克隆。另一类是在固相支持物表面进行的原位合成。原位合成又包括分子印章合成、压电打印和光引导等3种途径[15]。分子印章合成法是根据需要设计出一组图形不同的微阵列印章，然后把不同碱基的核苷酸涂在不同的印章表面，依次压印在基板表面；压电打印法通过压电晶体或其他方式从微小的喷嘴内把生物样品喷射到载体上，类似于喷墨打印技术；光引导即将光刻技术与DNA化学合成技术相结合，以化学合成的方法使DN段固定于芯片载体表面，一般用于寡核苷酸芯片的制作[16]。

1.3 分类

按照所用载体材料不同分类，可分为硝酸纤维素膜芯片、尼龙薄膜芯片等有机合成物片基型芯片；玻璃芯片、陶瓷芯片等无机片基型芯片[17]。据载体上所储存的生物信息的类型分类可分为寡核苷酸芯片、cDNA芯片。寡核苷酸芯片是指把已合成好的一系列寡核苷酸固定在介质上，制成高密度的寡核苷酸阵列，并与荧光标记的靶基因杂交进行检测。寡核苷酸芯片主要用于测序、点突变、表达谱分析等[18]。cDNA芯片是指用点样法制备的较低密度的尼龙膜或玻璃芯片，固定在芯片的探针是cDN段，把未知序列的cDN段用荧光标记后与靶基因杂交，通过点和耦合器件与激光共聚焦荧光扫描仪对信号强度进行检测[19]。根据基因芯片的功能分为基因表达谱芯片、测序芯片、克隆选择和文库筛选芯片、物种鉴定和基因组分型芯片、多态性分析芯片、突变检测芯片等。其中，基因表达谱分析是基因芯片技术应用最为广泛的，它使得人们能够更清晰地认识生命世界。表达谱芯片可将克隆到的大量基因特异的探针或其cDN段固定在一块DNA芯片上，对来源于不同个体或者同一个体的不同基因发生的变化进行检测[20]。目前的昆虫芯片主要是表达谱芯片，用于研究昆虫在发育过程中或在某一因素影响下昆虫基因表达谱的变化，例如在低温刺激、高温刺激、蛋白酶抑制剂、核型多角体病毒、农药胁迫下的基因表达谱等。

2 基因芯片检测到的解毒酶基因

解毒酶的活性显著增高是昆虫抗药性的重要机制之一，意味着对杀虫剂的解毒能力增强，加速代谢进入昆虫体内的杀虫剂，使其变为无毒或低毒物质，从而使杀虫剂不能达到作用部位，由此产生对杀虫剂的抗性，即代谢抗性[21]。代谢抗性作用的发挥依赖于细胞色素P450氧化酶（Cytochrome P450 monoxygneases，P450s）、非专一性酯酶（Estaesres，ESTs）、谷胱甘肽-S-转移酶（Glutathione-S-transferases，GSTs）三大解毒酶家族[22]。昆虫代谢抗性涉及氧化还原作用、水解作用、基团转移作用及轭合作用，通过上述生化过程把农药转变为易溶于水的极性分子，从而排出体外，达到抗药性效果[23]。表达谱基因芯片检测到的解毒酶基因表达情况见表1。

2.1 细胞色素P450氧化酶（P450）

P450是昆虫体内主要解毒酶系，是昆虫对DDT和拟除虫菊酯类等杀虫剂产生抗性的主要原因之一，并与昆虫交互抗性的产生密切相关，P450酶系的解毒代谢能力增强是因为抗性昆虫体内P450基因过表达。昆虫P450基因是由Ray首次发现的[24]，目前从已知的235个P450亚家族中已经克隆出1 000多个P450基因[25]。与抗性相关的P450基因主要有6个：CYP6A1、CYP6A2、CYP6A8、CYP6A9、CYP6B2和CYP6D1等[26]。

Daborn等[27]利用基因芯片技术和逆转录PCR技术对模式昆虫果蝇（Drosophila melanogaster）DDT抗性品系进行研究，在其P450基因组中发现只有CYP6G1转录水平很高，其mRNA的转录水平是敏感品系的10～100倍。通过基因芯片对果蝇的全基因表达谱的进行分析，发现CYP6G1基因发生了过表达，并发现了存在与对DTT产生抗性有关的等位基因，这等位基因是以嵌入CYP6G1基因的5′端进行表达的[28]。Goff等[29]通过聚合酶链式反应（PCR）扩增果蝇的132个基因，并将其制成基因芯片。这些基因中含有果蝇细胞色素P450家族多个基因，发现果蝇的一个野生抗性品系CYP6家族的基因发生了上调表达，并发现CYP6A8基因的上调表达与果蝇对烟碱类杀虫剂吡虫啉的抗性相关，但并不会导致抗性果蝇对马拉硫磷产生交互抗性；而果蝇对多种杀虫剂的交互抗性则被认为是与CYP6G1基因相关。

Shen等[30]通过PCR扩增和克隆的方式得到了淡色库蚊（Culex pipiens pallens）810个cDNA基因，其中24个CYP4基因被点样在尼龙薄膜制成微阵列cDNA芯片。这24个克隆基因发生了表达改变，通过查找GenBank发现这些克隆基因属于P450基因。在淡色库蚊抗溴氰菊酯品系及敏感品系中有CYP4H21、CYP4H22v1、CYP4H23v2、CYP4J4v2、CYP

4J6v1和CYP4J6v2等6个基因表达水平发生显著差异，且均在抗性品系中过表达，与敏感品系相比高达3.1～97.0倍。说明CYP4基因与淡色库蚊抗药性的产生有关。丁矛[31]利用中华蜜蜂（Apis cerana）、德国小蠊（Blattella germanica）等6种重要昆虫的41个昆虫抗药性相关基因，构建成含2 808个靶标点的昆虫抗药性相关基因芯片，并利用该芯片对淡色库蚊的抗性相关基因的差异表达进行研究，发现有6个细胞色素P450基因表达上调，其中3个属于CYP4家族，2个属于CYP6家族。

赵岩等[32]根据NCBI数据库公布的德国小蠊所有已知序列信息，设计合成寡核苷酸（Oligo）探针，去除冗余序列后共85条，点制在氨基基片上，制成德国小蠊基因芯片。利用该芯片对抗性品系与敏感品系德国小蠊进行表达谱检测，筛选与抗性相关的差异表达基因，并用实时荧光定量PCR进行验证。一共筛选出差异表达基因5个，其中有一个属于P450基因表达上调，并认为上调基因CYP6K1可能与抗性密切相关。Christian等[33]制作了冈比亚按蚊毒理芯片，发现CYP6P3、CYP6M3基因在雌雄中都出现了上调表达，但上调表达幅度都是雄虫高于雌虫。其余的P450基因例如CYP6P9、CYP6M2、CYP6R1、CYP12f2、CYP6AG1、CYP9J5、CYP9M1、CYP6Z1、CYP6AG2、CYP6M1、CYP9J等与敏感品系相比都出现不同程度的上调表达。Wang等[34]利用全基因组核苷酸序列基因芯片研究辛硫磷处理后的家蚕幼虫，24 h后，检测其基因表达情况。结果显示，6 177个基因在家蚕幼虫中表达，其中68个基因上调表达，且与对照组表达差异最大可达26倍；179个基因下调表达且最大可达29倍。对此的分析结果表明它们的功能可以分为10类：上调表达基因主要涉及脂肪代谢、糖代谢、蛋白水解等过程；下调表达基因主要涉及细胞分裂、转录调节、细胞内信号放大等过程。