抗Cetuximab单克隆抗体制备及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立

[摘 要]本研究利用Cetuximab 3次腹腔免疫6-8周龄BALB/c雌性小鼠。通过杂交瘤技术、间接ELISA 筛选技术及腹水制备等技术制备并获得抗Cetuximab单克隆抗体。实验结果表明，通过细胞融合成功得到三株能稳定分泌抗Cetuximab单抗的杂交瘤细胞株4C5、1F8和4B12，制备的腹水单克隆抗体纯化后效价为10-6以上，三株抗体重链均为IgG1亚类，轻链类型均为k链。利用制备的单克隆抗体（Mab）建立Cetuximab单抗双抗体夹心ELISA检测方法，试验结果显示，该检测方法特异性良好，不与其他抗体及蛋白发生交叉反应。

[关键词]Cetuximab 单克隆抗体 双抗体夹心ELISA

中图分类号：TM121.1.3 文献标识码：B 文章编号：1009-914X（2016）01-0017-01

Cetuximab是治疗结直肠癌的一种治疗性生物制品，其能够与 EGFR 的内源性配体EGF、TGF-α 竞争性地与EGFR 胞外配体区结合，抑制EGFR自身磷酸化，阻断下游信号转导通路，抑制生长因子激活细胞有丝分裂信号的下传，从而抑制肿瘤细胞增殖，且与抗肿瘤药物合用具有协同作用。抗Cetuximab单克隆抗体的制备和其双抗体检测方法的建立为开展Cetuximab药物代谢动力学研究奠定了基础。

1、材料

佐剂购自SIGMA公司；西妥西单抗由哈药集团技术中心制备；6～8周龄Balb/c小鼠购自北京实验动物研究中心；SP2/0细胞购自中国科学院上海生命科学研究院。

2、方法

2.1 单克隆抗体的制备

用纯化的Cetuximab按照萨姆布鲁克J等[1]报道的方法免疫5只Balb/c小鼠，经过3次基础免疫，选取效价最高（≥10000）的小鼠进行强化免疫。3～4天后利用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合，阳性杂交瘤筛选经过3次克隆，挑选获得的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆建库，阳性克隆细胞株扩大培养后注射Balb/c小鼠腹腔内诱生腹水，利用亲和层析方法纯化所得的小鼠腹水，进行SDS-PAGE 纯度鉴定和间接ELISA 测定抗体效价。

2.2 双抗体夹心ELISA检测方法建立

2.2.1 双抗体夹心ELISA最佳反应条件确定：参考李瑞等（ 2005） 、焦奎等（ 2004） 方法。

2.2.2 双抗体夹心ELISA方法特异性：按上述ELISA方法对鼠血清、人血清、猴血清、曲妥珠单抗及西妥昔单抗进行检测，以检验该方法的特异性。

2.2.3 双抗体夹心ELISA方法的灵敏度：将浓度为4ug/mL的Cetuximab连续作4倍梯度稀释，然后按照确定的ELISA反应条件进行测定。根据P/N值大于2.1，阳性值大于0.2，检验该方法的灵敏性。

3、结果与分析

3.1 单抗制备：通过Balb/c小鼠免疫、细胞融合、间接ELISA 筛选及细胞株克隆筛选获得3株稳定分泌Cetuximab单抗的杂交瘤细胞株4B12、1F8和4C5。用体内诱生腹水法分别制备4B12、1F8和4C5三株杂交瘤细胞的单克隆抗体，电泳纯度均在95%以上（电泳结果见图1）。纯化后腹水抗体效价为10-6以上。抗体亚类鉴定结果显示，所得的单克隆抗体重链为IgG1亚类，轻链为k链。抗体特异性鉴定结果显示，抗体均能与市售西妥西单抗发生高亲和力结合，但不与鼠IgG1和人IgG1发生交叉反应，说明其具有较好的特异性。

3.2 Cetuximab单抗双抗体夹心ELISA方法的确定

3.2.1 包被：用碳酸盐包被液稀释纯化的Cetuximab单抗至浓度1μg/mL，加入96孔酶标板，每孔100 μL，4℃包被过夜；

3.2.2 封闭：用PBST洗涤3次，拍干后，每孔加入300 μl 5%脱脂奶粉，37 ℃封闭1 h；

3.2.3 一抗浓度：PBST洗涤3次，拍干后，将待检样品进行1：1000倍稀释，Cetuximab标准品进行4倍稀释（4000～1ng），每孔加入100 μL，37℃孵育1h；

3.2.4 酶标二抗：将HRP标记羊抗人IgG-Fc抗体1：5000稀释，每孔加入100 μL，37℃孵育1h；

3.2.5 显色时间：PBST 洗涤3次，拍干，加入底物液（OPD），室温避光作用10min；

3.2.6 终止：每孔加入50 μL终止液（2M H2SO4），轻轻振摇混匀，测定OD492 值。

3.3双抗体夹心ELISA检测方法特异性的鉴定

试验结果显示，检测样品中只有市售西妥西单抗出现强阳性反应，其他均为阴性，表明此方法特异性较好。结果见表1。

3.4 双抗体夹心ELISA 方法灵敏度的测定

将纯化抗原的浓度稀释到4ug/mL，之后连续作4倍梯度稀释，按照确定的ELISA 反应条件进行测定，实验结果显示，该方法能检测出约0.89ng / mL 的抗体样本，显示出良好的灵敏度。

4、讨论

ELISA 检测方法常受到反应温度、pH、时间、酶标板的质量等多种因素影响，因此有关ELISA 的各种条件都需要进行优化。本研究对所建立的ELISA方法的各步缓冲液系统、溶液浓度、孵育时间等条件进行了摸索， 并最终确立反应条件。经验证，所建立的双抗体夹心ELISA检测方法具有良好的灵敏性和特异性，为西妥西单抗的药代动力学分析提供物质基础。

参考文献

[1] 萨姆布鲁克 J，拉塞尔 DW（黄培堂，等译）.分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社，2002，