HPLC法测定四年生黄芪中黄芪甲苷的含量

摘要: 目的 :建立一种准确、简便测定黄芪甲苷含量的分析方法。方法 :色谱柱为Nucleosil C18柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相为乙腈-水=1∶2;流速为0.8ml/min;检测波长为205nm;速度为0.4mm/min。灵敏度为0.1 AUFS,测定了黄芪甲苷的含量.平均回收率为96.73%,RSD为2.14%。结果:样品浓度在0.01～0.2mg\ml之间与峰面积成良好的线性关系。结论:本方法的重复性好、精密度高、稳定性强。

Abstract: 0bjective: Establish a determination simple and accurate method of the contents of Astragaloside. Method: The chromatographic column is Nucleosil the C18 column (4.6mm×250mm,5μm); The mobile phase its methyl cyanide - water =1∶2; The speed of flow is 0.8ml/min; The detective wavelength its at 205 nm; The speed is 0.4mm/min. The sensitivity is 0.1 AUFS, has determined the Astragaloside contents. The average returns is 96.73%, RSD is 2.14%. Result: the sample density in 0.01~0.2mg/ml has the good linear relationship with the peak area. Conclusion: This method's duplication is good, simple,rapid and accurate.

关键词: HPLC;四年生黄芪;黄芪甲苷

Key words: HPLC;quadrennium Astragalus;Astragaloside

中图分类号:R917 文献标识码:A文章编号:1006-4311(2010)08-0211-02

0引言

黄芪为常用中药,素有“补药之长”之称,具有益气固表,利尿托毒等功效。黄芪药用价值很高,临床上常用来治疗非特异性免疫功能低下、乙肝和心血管系统疾病。黄芪甲苷作为黄芪成分之一,其化学结构如图1所示,它具有降压、抗炎、稳定红细胞膜、提高血浆CAMP含量,促进小鼠再生肝DNA合成和增强免疫功能等多种作用.因此在研究黄芪过程中,我们对其成分黄芪甲苷进行了含量测定方法研究,本文用HPLC法测定黄芪甲苷的含量,其样品浓度的范围在0.01～0.2 mg\ml之间与峰面积呈线性,该法灵敏度高,重现性好,可准确地测定黄芪甲苷的含量。

1仪器与试剂

Waters高效液相色谱仪:包括510型泵,991光电二极管阵列型检测器,U6K型进样器;NEC Power Mate型计算机 ,黄芪甲苷标准品购自辽宁省药品检验所。甲醇、正丁醇为分析纯,乙腈为色谱纯、水为去离子水。试验用黄芪采自沈阳医学院草药园。

2方法与结果

2.1 色谱条件:色谱柱为Nucleosil C18柱(4.6 mm×250mm,5μm);流动相为乙腈-水=1∶2;流速为0.8 ml/min;检测波长为205nm;速度为0.4mm/min。

2.2 标准曲线制作:精密称取黄芪甲苷标准品2.128mg,加流动相定容至2ml,配制成1.064 mg\ml的标准品溶液,分别以10、20、30、40、50μl进样测定,以峰面积对进样量作线性回归,得回归方程为Y=-5.6×10-5+6.9365×10-4X(Y为峰面积,X为黄芪甲苷量),r=0.9994,黄芪甲苷标准品在10.64～53.20μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.3 提取方法的选择:用三种不同提取方法(索氏提取器提取1h;80℃温浸提取1h和超声波提取1h)提取样品,后两种提取方法测得黄氏甲苷含量略低,故选索氏提取器提取方法。

2.4 流动相的选择:实验试用多种溶剂系统,最后确定以乙腈-水=1∶2为流动相,黄芪甲苷分离效果最好,保留时间也较适宜。将样品、黄芪甲苷对照品及阴性样品,阴性样品的色谱带在与黄芪甲苷对照品色谱带中黄芪甲苷相应的位置上无吸收峰。样品色谱带在与黄芪甲苷对照品色谱带中黄芪甲苷相应的位置上有吸收峰。见色谱图见图2(ABC)。

2.5 样品液制备:将四年生黄芪干燥根研成粉过40目筛,然后精密称取5.00g,放置索氏提取器中,用100ml 80%甲醇加热提取2 h,提取液减压蒸去甲醇,用20ml正丁醇分别萃取3次,合并正丁醇萃取部分,减压蒸干,残渣用重蒸甲醇定容至2ml,用0.45μ微孔滤膜过滤,滤液用于HPLC分析,每次进样10μl。

2.6 回收率试验:称取四年生黄芪根粉5.00 g 5份,分别精密加入黄芪甲苷标准品2.00mg,按样品制备方法提取样品并进行定量分析,将测定结果扣除样品中黄芪甲苷含量,与加入标准品的比为加样回收率。结果为96.1%(n=5),RSD%=2.15(n=5)。

2.7 精密度试验:取同一样品液,重复进样5次,根据测得的样品中黄芪甲苷的浓度(μg\ml)计算其相对标准偏差为2.40%。又取同一样品5份,制备5份样品液,分别进样测出黄芪甲苷的浓度,计算其相对标准偏差为4.20%。

2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液,每隔2h进样1次,分别测定其色谱峰面积。RSD%=2.2(n=5),结果表明,色谱峰面积在8h内基本无变化,表明本实验条件下稳定性良好。

2.9 标准曲线的绘制按2.1项下的色谱条件,取2.2项下的标准溶液分别进样,测得的结果见表1。

回归方程:A= 2.26x102+1.93x107Cr=0.9992

2.10 回收率试验精密称取黄芪甲苷对照品约160mg、200mg和240mg各多份,按照2.5样品液制备的比例分别加入相同量的辅料混匀置于100ml量瓶中,加入甲醇溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,弃去初滤液,精密吸取续滤液1ml置25ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,对照含量测定项下方法测定,求得总平均植,计算回收率,结果见表2

X= 96.72%RSD=2.14%

2.11 四年生根及生药中黄芪甲苷的定量分析:依法测定一年黄芪根甲苷的含量,结果见表3。

讨论 黄芪甲苷是黄芪的主要有效成分之一,为定量分析黄芪中黄芪甲苷的含量,本实验建立了黄芪甲苷的RP-HPLC测定法,测得四年生黄芪根中黄芪甲苷的含量为1.51%(干重),与黄芪标准含量(1.50%)相差0.01%。本实验建立的RP-HPLC测定法加样回收率高,精密度试验相对标准偏差小,测试数据更可靠。

参考文献:

[1]王春福.高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定心舒康片中黄芪甲苷的含量《吉林中医药》,2007年 第27卷 第09期 0056.

[2]周国莉.高效液相色谱法测定中药固本片中黄芪甲苷的实验研究《中国医学创新》2008.第5卷 第34期 091.

[3]侯璐.HPLC-ELSD法测定复方养心片中黄芪甲苷的含量《天津药学》2008年 第20卷 第02期 0023.