香青兰总黄酮在脑缺血损伤中的作用机制

引 言

黄酮类化合物系指由两个具有酚羟基的苯环通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，是植物在长期自然选择中通过光合作用产生的次级代谢产物，存在于叶、皮、根、花和果实中[1]。药理作用研究表明，黄酮类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、治疗心脑血管疾病等作用[2～4]。林健等[5]发现，橄榄总黄酮能缓解脑缺血 / 再灌注所引起的脑组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO) 的升高趋势，减轻中性粒细胞在脑组织中的浸润程度，从而减轻脑损伤。黄酮类物质葛根素可通过抑制肿瘤坏死因子 -α 和中性粒细胞的激活，减轻脑缺血再灌注损伤后脑组织中的炎症反应[6]。蜂胶黄酮则可抑制白介素 -1β、肿瘤坏死因子-α和白介素-6 的表达，从而抑制脑缺血 / 再灌注后的炎症反应，缩小脑梗死体积，改善神经功能缺损[7]。香青兰为唇形科植物香青兰 Dracocephalum moldavica L.的干燥地上部分，维吾尔医称之为巴迪然吉布亚，有益心护脑、开通脑中闭塞、保肝健胃之功效，被用于治疗心脏病、高血压、寒性神经性头痛、寒性感冒、气管炎等[8]。本研究采用线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型，研究香青兰总黄酮(total flavones of Dracocephalum moldavica L.，TFDM) 的脑保护作用，并探讨其机制，为其应用提供参考依据。

材料与方法

动物

雄性Wistar大鼠，体重(220±20) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK (京) 2007-001。

试剂

香青兰总黄酮(纯度≥80%)：新疆维吾尔自治区药物研究所；2,3,5- 氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)：北京拜尔迪生物技术有限公司；MPO 测试盒：南京建成生物工程研究所；细胞间黏附分子 -1 (intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)抗体：北京博奥森生物技术有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

仪器

IX51 倒置显微镜：日本奥林巴斯公司；多功能酶标仪：Sigma 公司；TGL 16M 离心机：湖南凯达科学仪器有限公司；水浴锅：江苏省金坛市医疗仪器厂；涡旋混合器：江苏海门市麒麟医用仪器厂。

动物分组及给药

Wistar大鼠随机分为 5 组：模型组、假手术组，以及香青兰总黄酮高、中、低三个剂量组(50、25、12.5 mg/kg)，每组 8 只。分别灌胃给药或给予相同体积的蒸馏水，每天一次，连续 5 d，末次给药后 1 h 实施手术。

脑缺血再灌注模型的建立

将大鼠用 10%水合氯醛 (350 mg/kg, i.p.) 麻醉后，仰卧固定，沿颈部中线切开皮肤，分离皮下筋膜及肌肉组织。分离左侧颈总动脉 (common carotid artery，CCA) 及其颈内动脉(internal carotid artery，ICA) 和颈外动脉 (external carotid artery，ECA)。远心段结扎ECA，夹闭 CCA 和 ICA。在 ECA 上开一小口，将直径为 0.26 mm 的鱼线沿 ECA 穿过 ICA和 ECA 分叉处进入 ICA。松开 ICA，继续将鱼线插入到 ICA 颅内段。自 ICA 起始部的插入长度约为 1.8～1.9 cm，表明线的头端已穿过大脑中动脉起始部，结扎 CCA 和 ICA。术中白炽灯加温，维持大鼠肛温约 37℃。术后缝合伤口，动物回笼。缺血 2 h 后拔出线栓至 ECA和ICA 分叉处，实现再灌注。假手术组大鼠仅施行手术而不插入鱼线。

脑梗死面积的测定

大鼠脑缺血2 h 再灌注 22 h 后，断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，用生理盐水冲洗大脑表面血污，－20℃冰冻15 min 后，冠状切片。迅速将脑片至于 1%的 TTC 磷酸缓冲溶液中，37℃避光水浴 30 min，然后置于 10%的中性甲醛溶液中固定。正常脑组织呈红色，梗死脑组织呈白色。对每张脑片的正反两面进行扫描，用图像分析软件 Photoshop 6.0 求出梗死面积。

组织病理学观察

缺血 2 h 再灌 22 h 后，将大鼠深度麻醉，迅速打开胸腔，暴露心脏，用镊子捏住心脏，将针头从心尖部位插入，向上进针到升主动脉，用剪刀在右心房处剪一小口，灌注4%多聚甲醛，直至回流液变清后，断头取脑，再用 4%多聚甲醛固定 24 h。取各实验组大鼠大脑视交叉至漏斗柄冠状切面的脑组织，常规石蜡包埋，作连续切片，切片厚度为 5 μm，进行常规 HE 染色，观察病理形态学改变。

MPO 的活性测定

缺血2 h再灌注 22 h 后，将大鼠断头取脑，取缺血侧脑组织，利用试剂盒提供的匀浆介质，将脑组织制成 10%的组织匀浆，按照试剂盒操作步骤进行检测。

ICAM-1 表达的测定

石蜡切片经常规脱蜡、水化后，滴加 ICAM-1 一抗，按试剂盒说明书对标本进行常规链霉亲和素 - 生物素 - 过氧化物酶复合物 (streptavidin biotin-peroxidase complex，SABC)法染色，二氨基联苯胺显色，蒸馏水冲洗，脱水，透明，封片。每张切片在缺血区随机采集高倍(×400)视野，观察ICAM-1 阳性表达细胞。

统计学分析

采用 SPSS13.0 for Windows 统计软件进行分析。实验数据均以平均值±SD 表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，两组间数据比较采用t检验。P ＜0.05表明具有显著性差异，P ＜0.01表明具有极显著性差异。

结 果

香青兰总黄酮对脑梗死面积的影响

模型组大鼠经 2 h 的大脑中动脉栓塞和 22 h 的再灌注后，缺血侧大脑出现明显的梗死灶，梗死面积与假手术组相比，具有显著性差异(t=23.796，df=7，P ＜0.01)。TFDM预处理可明显缩小脑梗死面积，其中，TFDM 高、中剂量组与模型组比较，差异具有统计学意义(t=3.690，df=7，P ＜0.01；t=2.692，df=7，P ＜0.05)，见表 1、图 1。

香青兰总黄酮对脑组织MPO 活性的影响

与假手术组比较，模型组MPO 活性明显升高 (t=5.759，df=7，P ＜0.01)。与模型组比较，TFDM 高、中剂量组 MPO 活性显著降低，差异有显著性 (t=4.083，df=7，P ＜0.01；t=3.243，df=7，P ＜0.01)，见表2。

香青兰总黄酮对脑组织ICAM-1 表达的影响

假手术组大鼠脑组织偶见 ICAM-1 阳性表达细胞。模型组 ICAM-1 表达明显增加，棕黄色反应物弥散分布在细胞浆内，着色深，与假手术组比较有显著性差异。香青蓝总黄酮组 ICAM-1 阳性表达明显减少，阳性细胞数减少，着色较浅，与模型组比较有显著性差异。具体结果见图3。

讨 论

越来越多的临床及动物实验研究资料表明炎症反应是脑缺血发病的重要危险因素之一，也是引起脑缺血再灌注损伤的主要原因[9]。脑缺血后的炎症级联反应是缺血区细胞因子、细胞黏附分子及各种炎症细胞相互作用的动态过程[10]。Berti 等[11]研究发现，大鼠脑缺血2 h 再灌注 3 h 后，梗死区 ICAM-1 mRNA 水平逐渐升高，24 h 时为非缺血侧的 5 倍，72 h 时达到顶峰。ICAM-1 表达上调可介导白细胞与内皮细胞黏附，引起白细胞聚集、浸润，诱发白介素 -1、白介素 -6、肿瘤坏死因子 -α 等炎性细胞因子和一氧化氮等炎症介质过表达，它们的过表达又能反馈式地刺激 ICAM-1 在数量和功能上的明显上调，加剧炎症级联反应，进而促进脑缺血 / 再灌注损伤[12]。中性粒细胞是缺血区主要的效应细胞，通过多种途径介导缺血 / 再灌注损伤：中性粒细胞聚集、黏附造成微血管阻塞，导致脑血液循环重建后的“无复流”现象；中性粒细胞产生大量自由基，引起脑组织氧化损伤；活化的中性粒细胞释放弹性蛋白酶、胶原酶等，降解细胞外基质成分，而细胞外基质成分对于维持血脑屏障至关重要；中性粒细胞释放炎症介质增加血管通透性，引起水肿、血小板聚集增加[13]。MPO是中性粒细胞中的特异性酶，位于噬天青颗粒中，其活性可反映中性粒细胞的浸润程度[14]。香青兰中已明确的黄酮类物质包括山奈素、洋芹素、异鼠李素、木犀草素[15,16]等。有文献报道洋芹素在局灶性脑缺血中可通过减弱诱生型一氧化氮合酶和环氧合酶-2 蛋白的表达，抑制小胶质细胞中一氧化氮、前列腺素 E2 的生成[17]。山奈素、异鼠李素及木犀草素也被证实具有抗脑缺血或抗炎作用[18]。本实验结果表明，香青兰总黄酮可有效抑制脑缺血再灌注后的炎症级联反应，表现为降低脑组织 MPO 活性和 ICAM-1 的表达，从而减少脑梗死面积及组织病理学变化，发挥脑保护作用。