补肾中药对帕金森病模型小鼠黑质-纹状体神经元的保护作用*

帕金森病(Parkinson’s disease)是常见于中老年人的神经退行性疾病,随着人口的老龄化,本病的发病率正在逐年递增,严重影响患者的生活质量。中医理论有肾主骨生髓,脑为髓之海,因此可以通过滋补肾脏来补益脑髓,现代研究也表明:以补肾为主的方药可延缓PD过程,改善 PD患者的生活质量。本实验通过对PD模型小鼠神经凋亡因子和神经营养因子的检测探讨补肾中药治疗PD的可能途径。

1材料与方法

1.1 实验动物

7周龄SPF级C57BL/6J品系雄性小鼠90只,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司(合格证号:SCXK(泸)2007-0005),体重20±2g。置于福建中医药研究院实验动物中心SPF级动物饲养室饲养并建造模型,室温20-22℃。小鼠全价颗粒饲料由建中医药研究院实验动物中心提供。

1.2 药品、试剂与仪器

淫羊藿,小檗科箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum Maxim.的地上部分,产地四川;女贞子,木犀科女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实,产地浙江;黄精,百合科多年生草本植物黄精Polygonatum sibiricum Red.的根茎,产地河北;司来吉兰,南京思科药业有限公司生产,5m*10。以上药品均由福建医药集团提供。

淫羊藿、女贞子、黄精经福建中医学院药学系杨成梓副教授鉴定,并经福建中医学院中药生药学实验室测定:紫外分光光度法测定淫羊藿中总黄酮以淫羊藿苷计得率为12.4%、黄精中黄精多糖以无水葡萄糖(C6H12O6)计,得率为13.2%;HPLC法测定女贞子中齐墩果酸和淫羊藿中淫羊藿苷分别为1.37%和2.67%。证实原材料符合10版药典的质量标准,可用于进一步实验研究。

1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氢吡啶盐酸盐(MPTP・HCl),订购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;FasL抗体、FasL抗体同型对照、Fas抗体、Fas抗体同型对照、Caspase-3试剂盒、Caspase-3抗体同型对照及Bcl-2试剂盒均由美国BD公提供;小鼠NGF、BDNF、GDNF的ELISA试剂盒均由上海西唐生物科技有限公司提供。

主要实验仪器:多功能小鼠自主活动记录仪(YLS-1A,淮北正华)、小鼠转棒疲劳仪(YLS-4C,淮北正华)、透射电镜(H7650,日本日立公司)、流式细胞仪(Facscalibur,美国BD公司)、全自动酶标仪(XL800,美国Bioteck公司)。

1.3 帕金森病模型的制备、小鼠分组及给药

C57BL/6J品系雄性小鼠腹腔注射MPTP・HCl, 25mg/(kg・d),1次/2天,连续18次。每次注射后至少4h后检测小鼠的自主活动次数和转棒时间,最后一次检测后统计分析小鼠的活动情况,选自主活动次数和转棒时间均下降小鼠为造模成功小鼠。

取正常11周龄SPF级C57BL/6J品系雄性小鼠8只作为正常对照组,取40只造模成功的小鼠随机分为淫羊藿组、女贞子组、黄精组、司来吉兰组及模型对照组5组,每组8只。淫羊藿组、女贞子组、黄精组、司来吉兰组分别灌胃给予淫羊藿女贞子、黄精、司来吉兰的水煎液及水溶液,正常对照组及模型对照组均给予蒸馏水。每次灌胃0.5mL,每天2次,连续给药4周,每天给药时间为8:00和16:00。淫羊藿、女贞子、黄精、司来吉兰剂量分别为6g/kg/d、6g/kg/d、8g/kg/d、2mg/kg/d,相当于成人常用量。

1.4 药物制备

分别称取淫羊藿36g、女贞子36g、黄精48g加入600ml的蒸馏水中,浸泡60min后,煎煮300mL药液,药液浓度分别为120mg/ml、120mg/ml、160mg/ml,过滤后装瓶密封消毒, 4℃冷藏备用。

司来吉兰12mg,用双蒸水溶解配制成300mL的水溶液,药液浓度为0.04 mg/ml,装瓶密封消毒, 4℃冷藏备用。

1.5 标本采集及观察项目

给药后小鼠每组取7只快速脱颈椎处死,用眼科剪开颅迅速取脑。生理盐水冲洗去除大脑皮层表面的脂肪组织。参考《The Mouse Brain》[14]及《大鼠脑立体定位图谱》[15]在冰浴中切取黑质-纹状体。小鼠右侧的黑质-纹状体用眼科剪剪成糊状加PBS,以200目的尼龙网滤成单细胞液体,离心去上清,加PBS混匀并调整细胞浓度为1×106/mL单细胞悬液流式检测Fasl、Fas、Caspase-3、Bcl-2;左侧黑质-纹状体0.1g组织加入生理盐水1mL的比例匀浆取上清ELISA法检测NGF、BDNF、GDNF。每组1只小鼠快速脱颈椎处死,用眼科剪开颅迅速取脑。生理盐水冲洗去除大脑皮层表面的脂肪组织。参考《The Mouse Brain》[14]及《大鼠脑立体定位图谱》[15]在冰浴中切取黑质,置于电镜固定液中送检。

1.6 流式检测Fasl、Fas、Caspase-3、Bcl-2

取黑质-纹状体单细胞悬液100μL加5μL抗体或抗体同型对照涡旋混匀,室温避光保存15min;然后加PBS 2mL,1000rpm离心5min;弃上清,加PBS 500μL重悬后上机检测。

1.7 ELISA检测NGF、BDNF、GDNF

取黑质-纹状体匀浆上清100μL加入酶标版孔中,加待检抗原,37℃孵育30min,洗涤3次、抛干;加抗体,37℃孵育30min,洗涤3次、抛干;加底物液,37℃孵育15min,加终止液;全自动酶标仪测定其OD值。

1.8 统计分析

实验数据在Microsoft Windows XP系统下采用SPSS13.0进行处理。检测结果用x±s表示。用药后组间数值比较,用完全随机设计的单因素方差分析,组间差异的多重分析用LSD或Games-Howell法。检验水准=0.05。

2结果

2.1 各组小鼠用药后Fasl、Fas、Caspase-3、Bcl-2含量比较结果

淫羊藿组和女贞子组FasL的含量与空白对照组、司来吉兰组及模型对照组无明显差异(p>0.05);黄精组FasL的含量明显低于模型对照组(p0.05)。淫羊藿组、女贞子组和黄精组的Fas的含量与空白对照组、司来吉兰组及模型对照组无明显差异(p>0.05)。淫羊藿组、女贞子组及黄精组的Caspase-3的含量均低于模型对照组(p0.05)。淫羊藿组、女贞子组和黄精组Bcl-2含量均与空白对照组、司来吉兰组及模型对照组没有显著差异(p>0.05)(见表1、图3)。

表1各组小鼠用药后神经相关凋亡因子的水平

组别 FasL Fas Caspase-3 Bcl-2

n n

空白对照组 6 4.968±2.934 7 1.733±0.813 1.510±0.317 1.844±0.522

淫羊藿组 6 4.475±2.665 7 1.541±0.312 2.490±1.548# 2.156±0.505

女贞子组 6 5.302±2.644 7 2.275±1.767 2.015±0.561# 2.397±1.869

黄精组 6 2.465±2.045# 7 1.523±0.643 2.191±0.405# 1.300±0.679

司来吉兰组 6 4.170±4.322# 7 0.930±0.598 2.139±0.638# 2.156±0.711

模型对照组 6 6.473±1.426* 7 1.917±1.359 3.872±0.448 1.567±0.325

*与空白对照相比较,p

2.2 各组小鼠用药后NGF、BDNF、GDNF含量比较结果

黄精组中NGF的含量明显高于模型对照组、司来吉兰组(P0.05);淫羊藿组和女贞子组中NGF的含量与模型对照组和司来吉兰组均无明显差异(p>0.05)。淫羊藿组和黄精组中的BDNF的含量均高于模型对照组和空白对照组(P0.05),黄精组明显高于司来吉兰组(P0.05)。淫羊藿子、女贞子组和黄精组中GDNF的含量与空白对照组、司来吉兰组和模型对照组均无差异(p>0.05)(见表2、图4)。

表 2各组小鼠用药后神经相关保护因子的OD值

组别 NGF BDNF GDNF

n n

空白对照组 7 0.213±0.081 0.251±0.027 6 0.125±0.011

淫羊藿组 7 0.162±0.142 0.334±0.086# 6 0.121±0.013

女贞子组 6 0.170±0.011 0.291±0.060 6 0.117±0.015

黄精组 6 0.204±0.048# 0.375±0.186* # 7 0.137±0.007

司来吉兰组 7 0.178±0.039* 0.297±0.100 7 0.135±0.025

模型对照组 6 0.176±0.012* 0.245±0.013 6 0.122±0.027

*与空白对照相比较,p

2.3 各组小鼠用药后黑质神经元的形态变化

正常对照组小鼠黑质神经元电镜下观察到胞膜和细胞器完整,线粒体、高尔基复合体丰富,有少量溶酶体,染色质散在于核的中部,着色浅;模型组小鼠黑质神经元在电镜下则观察到胞体缩小,核浆比例缩小,胞核固缩,染色质边集,内质网扩张呈空泡状等凋亡表现;淫羊藿组、女贞子组及黄精组小鼠黑质神经元核内胞核固缩及染色质边聚表现较模型组有减轻,内质网扩张状态不明显,溶酶体含量较多(见图5)。

正常对照组 淫羊藿组女贞子组

黄精组司来吉兰组模型对照组

图3各组模型小鼠用药后黑质神经元电镜图片(×8000)

3讨论

帕金森病的主要病理改变为中脑黑质致密带多巴胺能神经元的变性、丢失。大量的研究表明凋亡参与了PD多巴胺能神经元的变性、缺失。PD患者DA能神经元的凋亡除了有形态学上的改变,还有研究证明凋亡因子也参与了多巴胺神经元的变性、缺失,在PD患者活检的黑质组织中发现激活的Caspase-1、3、8、9等的比例高于正常对照组,相关凋亡因子P53、CD95、Bax-XL的表达也增高。此外在MPTP诱导的PD小鼠模型中也发现C-Jun、BaxmRNA的表达上调,而凋亡抑制因子Bcl-2的表达下调[30-34]。而且细胞凋亡主要是通过caspases家族降解底物蛋白诱导的,因此,阻断Caspases的激活成为治疗PD,阻止其病情发展的重要途径。有研究表明补肝肾、补脾肾的单味药及方剂都可以上调实验动物脑中Bcl-2的表达、降低Caspases-3、Fas及FasL的表达,从而减少神经元的凋亡[39-42]。本实验中淫羊藿、女贞子可以降低PD模型小鼠脑黑质-纹状体中Caspase-3的含量;黄精可以降低PD模型小鼠脑黑质-纹状体中Caspase-3、FasL的含量;淫羊藿、女贞子和黄精对抗凋亡因子Bcl-2均没有明显的作用。与以往补益中药可以下调模型动物Caspases-3、FasL的的含量一致。

神经营养因子(neurotrophic factors,NTFs)是一类由神经元、神经支配的靶组织或胶质细胞产生并分泌的小分子多肽或蛋白质,它们通过与其相应受体结合而启动效应神经元存活、生长、分化,在神经系统的发育和生理功能维持中起着重要作用。其中NGF、BDNF、GDNF在中脑能促进多巴胺能神经元发育、分化和存活并在多巴胺神经元神经损伤后再修复过程中发挥重要作用[57-59],是治疗PD最具潜力且副作用较小的治疗药物,但NGF、BDNF、GDNF作为蛋白大分子,难以通过血脑屏障,使其临床应用受到限制。如何促进内源性的神经神经营养因子的释放,已成为治疗神经退行性病变的新的研究途径。现代临床研究也表明培补肝肾类方药对改善PD的症状具有良好的疗效[60]。本实验中淫羊藿可以升高PD模型小鼠脑黑质-纹状体中BDNF的内源性含量;黄精也可以增加PD模型小鼠脑黑质-纹状体中BDNF、NGF的内源性含量,黄精上调BDNF的程度可以使脑内BDNF的含量超过正常水平;女贞子则对PD模型小鼠脑黑质-纹状体中内源性神经营养因子没有明显作用。补肾方药对帕金森患者的疗效可能通过提高脑内神经营养因子的含量起作用的。

中医经典著作虽无“ 帕金森病”一名,但在《内经》、《中藏经》等中医经典著作中已有对震颤、强直、姿势障碍、运动麻痹、慌张步态等帕金森病的症状及病机论述。《内经》认为“肾虚髓空为发病之本”。王肯堂在《证治准绳》中记载:“此病壮年鲜,中年以后乃有之”。帕金森病主要表现为肢体活动失调,且发病年龄在进入肾气衰退的中老年时期,故肾虚髓空是导致帕金森病发生的内在条件,补肾益髓是治疗帕金森病的重要方法。临床研究也证实:以补肾为主的方药对PD患者的疗效显著,可以有效缓解PD临床症状,减缓PD的病情进展。本实验证实补肾中药可以降低PD模型小鼠黑质-纹状体中相关凋亡因子的含量、增加神经营养因子的含量,而电镜下观察到得结果表明给药后DA能神经元的凋亡程度有所减轻。补肾中药可能通过降低黑质-纹状体中相关凋亡因子的含量、增加神经营养因子的含量来改善DA神经元的凋亡,从而达到改善PD临床症状、延缓PD进展的疗效的。

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