姜黄素对黑色素瘤B16—F10细胞增殖及线粒体凋亡影响的机制研究

[摘　要]　目的：探讨姜黄素体外抗黑色素瘤的药效及作用机制，为姜黄素抗肿瘤的药理机制提供实验依据。方法：以黑色素瘤B16—F10细胞为实验材料，在离体水平研究姜黄素对细胞活力、细胞内活性氧水平、细胞凋亡的影响［1］。结果：姜黄素能显著抑制B16—F10细胞增殖、促进其凋亡；姜黄素可促进B16—F10细胞活性氧水平增高，且显著提高细胞内Caspase—4，9蛋白的表达，可能通过启动线粒体凋亡途径发挥促癌细胞凋亡生物活性。结论：姜黄素对黑色素瘤具有显著抑制作用［2］，其可能的机制是通过提高细胞内活性氧水平，启动线粒体凋亡途径而发挥促黑色素瘤细胞凋亡的作用。

[关键词]　姜黄素；黑色素瘤；B16—F10细胞株；线粒体凋亡

黑色素瘤是由异常黑素细胞过度增生引发的常见的皮肤肿瘤，其特点是恶性程度高、进展快、死亡率高［3］。临床恶性黑色素瘤的治疗常采用手术结合联合化疗方案［4］。本研究以黑色素瘤细胞株B16—F10为实验材料，观察姜黄素体外抑瘤作用。同时，以活性氧激活线粒体凋亡途径为切入点，探讨姜黄素抗黑色素瘤的可能分子机制［5］，进而推断姜黄素的分子药理学作用。

1　材料与方法

材料：姜黄素（纯度≥98%）；RPMI1640、胎牛血清、HEPES、EGTA、BSA、DMSO等；MTT；DCFH—DA活性氧探针；线粒体提取试剂盒；Caspase—9（p—35，sc—8355）兔抗小鼠多克隆抗体；Caspase—4（ab—25898）兔抗小鼠多克隆抗体；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒；常规生化试剂；B16—F10小鼠皮肤黑色素瘤细胞株。

方法：①细胞培养：B16—F10细胞常规培养，每3天传代一次，实验时取对数生长期细胞，用0.25%Trypsin—EDTA液消化后，用培养基制成细胞悬液。②细胞生长活力测定：细胞于96孔板培养24、36、72小时；向待检测的细胞培养板中加入MTT溶液（每孔20μl），于CO2培养箱中孵育4小时；吸出培养板中的液体，加入100μl DMSO溶液，置于振荡器混匀10分钟，酶标仪在450nm波长下测OD值；采集数据，依照下列公式计算细胞生长抑制率：（1—实验组OD值/对照组OD值）×100%。③DCFH—DA活性氧检测：实验方法依照试剂盒说明进行，采用激光共聚焦显微镜观察，530nm发射波长附近激发为绿色。④细胞涂片TUNEL染色、荧光显微镜观察：细胞接种于6孔板（3ml/孔），细胞接种密度4×105 cells/ml，被试药物干预24、48小时后收集细胞、预冷的0.1M PBS洗3次，用细胞离心涂片机将细胞甩到多聚赖氨酸包被的载玻片上；4%多聚甲醛固定30分钟、风干；1% Triton X—100 PBS透膜；加入TdT酶、荧光标记液及TUNEL检测液、孵育60分钟；抗荧光淬灭液封片、荧光显微镜观察、摄片。⑤细胞涂片Caspase—4，9抗体免疫组织化学显色、光镜观察：细胞接种于6孔板（3ml/孔），细胞接种密度4×105 cells/ml，被试药物干预24、48小时后收集细胞、预冷的0.1M PBS洗3次，用细胞离心涂片机将细胞甩到多聚赖氨酸包被的载玻片上；4%多聚甲醛固定、风干；1%Triton X—100 PBS透膜；正常动物血清封闭抗原；加一定稀释度的Caspase—4，9一抗（50μl/片），4℃湿盒孵育、过夜；加入通用型2抗PV—6001；AEC显色（红色）、光镜观察、摄片。

统计学处理：定量数据采用SPSS11.0软件包进行统计学分析，结果以X±S表示，组间比较采用单因素方差分析，t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

姜黄素对B16—F10细胞生长抑制率的影响：用12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml四个浓度姜黄素孵育B16—F10细胞24、48和72小时，倒置显微镜下可观察到随着药物作用时间的增加B16—F10细胞形态学的变化：细胞变圆、体积缩小、悬浮细胞（脱落）显著增多。MTT法检测，数据换算、统计分析结果表明姜黄素对B16—F10细胞的生长抑制存在时间和剂量的依赖性。

姜黄素对B16—F10细胞氧化损伤：依照前期实验的结果，本实验选择50μg/ml的给药剂量作用体外培养的B16—F10细胞。分别在孵育24、48小时采集细胞，采用DCFH—DA活性氧检测试剂盒，在激光共聚焦显微镜下观察姜黄素对B16—F10细胞活性氧水平的影响。结果表明姜黄素孵育48小时，能显著增高B16—F10细胞内活性氧水平，引起细胞形态改变。与对照组比较，姜黄素孵育48小时，B16—F10细胞内活性氧自由基水平显著增高（P＜0.01）。

姜黄素对B16—F10细胞凋亡的影响：一步法TUNEL染色，荧光显微镜观察，绿色荧光示凋亡细胞。实验结果表明姜黄素作用24小时可诱导少量B16—F10细胞凋亡，作用48小时可诱导大量B16—F10细胞凋亡，图像分析结果显示与空白对照组比较，姜黄素作用48小时B16—F10凋亡细胞显著增多（P＜0.01）。

姜黄素对B16—F10细胞线粒体凋亡相关蛋白Caspase—4，9的影响：已知Caspase—9是诱发线粒体凋亡过程的关键蛋白，位于细胞的胞浆内；而Caspase—4同样是诱发细胞凋亡的起始因子，位于内质网膜上，二者共同介导氧化应激作用诱导的线粒体凋亡过程。依照前期实验的数据，本实验选择50μg/ml的给药剂量作用体外培养的B16—F10细胞。分别在孵育24、48小时采集细胞，用离心法制备细胞涂片，行常规免疫组织化学染色，测定姜黄素对B16—F10细胞Caspase—4，9表达的影响，结果表明姜黄素干预B16—F10细胞，可显著上调细胞内Caspase—4，9水平。

3　讨论

姜黄素通过诱导细胞凋亡发挥体外抗肿瘤作用：本实验观察到，姜黄素能够显著抑制黑色素瘤B16—F10细胞生长，且呈剂量和时间依赖性。该结果与桂飞等［6］的研究结果一致。细胞凋亡实验结果表明，姜黄素具有诱导肿瘤细胞凋亡的生物活性，作用B16—F10细胞48小时可探测到大量的凋亡细胞；与线粒体凋亡相关因子caspase—4，9检测结果表明，姜黄素作用B16—F10细胞48小时能显著升高细胞内caspase—4，9的水平。该实验结果初步提示姜黄素不仅直接杀伤肿瘤细胞，而且能通过诱导细胞凋亡表现为显著的抑瘤活性。

生命体受到各种有害刺激时，体内活性氧自由基（ROS）呈增多的趋势，称氧化应激［7］。已有研究发现，ROS是多种药物诱导细胞凋亡过程中的一个重要信号分子，与肿瘤形成、肿瘤治疗密切相关。本研究发现，姜黄素可诱导B16—F10细胞内ROS水平的迅速增高，初步提示姜黄素可能通过诱导肿瘤细胞产生ROS，提示姜黄素诱导细胞凋亡可能通过启动线粒体凋亡过程而实现。