鬼箭锦鸡儿抗血栓活性部位筛选

[摘要] 该实验通过建立大鼠下腔静脉血栓模型和小鼠急性肺血栓模型，考察鬼箭锦鸡儿醇提物（TE）的抗血栓作用。通过考察TE的2个主要部分TE-1和TE-2对小鼠急性肺血栓的作用，以及比较TE、TE-1和TE-2对出血时间和凝血时间的影响，探索其抗血栓活性部位。通过对照品对照结合液相色谱-质谱分析对提取物中所含6种主要成分及其他成分的种类或类别进行鉴定。结果表明，TE各剂量组均能够显著降低大鼠下腔静脉血栓质量（P

[关键词] 鬼箭锦鸡儿；抗血栓；活性部位；下腔静脉血栓；急性肺血栓； UPLC-DAD-q-TOF-MS

[Abstract] The antithrombotic effect of Caragana jubata （Pall.）Poir.ethanolic extract （TE）was evaluated by inferior vena cava thrombosis in rats and acute pulmonary thrombosis in mice. To search for the bioactive fractions of TE， comparison on acute pulmonary thrombosis was made between the two main fractions of TE （TE-1 and TE-2）. Besides， pharmacological effects of TE， TE-1 and TE-2 on bleeding time and clotting time were also studied. Reference substances combined with UPLC/DAD-q-TOF-MS were applied to identify the main six compounds and other chemical constituents of the TE. The results showed that TE could significantly reduce the rat thrombosis weight in all doses （P

[Key words] Caragana jubata；antithrombus；bioactive fractions；inferior vena cava thrombosis；acute pulmonary thrombosis；UPLC-DAD-q-TOF-MS

doi：10.4268/cjcmm20161317

鬼箭锦鸡儿Caragana jubata （Pall.） Poir.属于豆科锦鸡儿属植物，又名作毛兴，作为藏医民间用药，其根茎具有活血化瘀、降压、消炎止痛等功效[1-2]。目前关于锦鸡儿属植物的药理研究有很多，大多集中于抗炎、抗肿瘤、抗HIV、抗氧化、降糖、降压及细胞毒活性等方面[3-5]；抗血栓及抗心律失常作用仅有关于小叶锦鸡儿C.microphylla Lam.的研究报道[6-7]。陈龙[8]通过实验发现锦鸡儿石油醚部位具有一定的体外抗凝血作用。本研究通过建立大鼠下腔静脉血栓和小鼠急性肺血栓2种血栓模型，探究鬼箭锦鸡儿醇提物的体内抗血栓活性，为进一步寻找其活性部位，本实验还考察了鬼箭锦鸡儿醇提物经固相萃取处理后得到的2个主要部分在急性肺血栓方面的作用以及对出血时间和凝血时间的影响，并采用对照品加入法，对鬼箭锦鸡儿醇提物中的主要化学成分进行了鉴定，对其2个主要部分中的化学成分类别采用液质联用法进行了在线鉴定。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠，体重240～260 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号SCXK（京）2012-0001。雄性昆明小鼠（18～22 g），由中国人民军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心提供，许可证号SCXK（军）2014-0001。所有动物均饲养于中国医学科学院生物医学工程研究所动物房。

1.2 药材与试剂

鬼箭锦鸡儿红色木部心材采自青海海拔3 000 m以上的地区，由青海民族学院宋萍教授鉴定为鬼箭锦鸡儿C.jubata（标本存放于天津大学药物科学与技术学院天然药物研究室，编号Y200501）。对照品1～6（分别为5，7，4′-三羟基-3′-甲氧基异黄酮、7，4′-二羟基黄酮、7，2′-二羟基-6，4′-二甲氧基异黄酮、7，3′-二羟基-4′-甲氧基异黄酮、4′-羟基-6，7，3′-三甲氧基异黄酮、L-高丽槐素）为本课题组分离鉴定的单体化合物，HPLC归一化法测定纯度均大于90%。阿司匹林肠溶片（批号018150305，规格25 mg×100片）由石药集团欧意药业有限公司生产；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，批号20010111）出自华北地区特种化学试剂开发中心（天津）；10%水合氯醛由Leagene生物科技有限公司提供（批号0813A15）；柠檬酸三钠（批号20150110）为分析纯试剂，购买于天津科密欧化学试剂有限公司；胶原蛋白购自Sigma公司（C9879）；盐酸肾上腺素注射液（批号1408231）由天津金耀药业有限公司生产；95%乙醇为分析纯，购自天津基准化学试剂有限公司；冰乙酸为分析纯，由天津市江天化工技术有限公司提供；甲醇为分析纯，购自天津基准化学试剂有限公司；乙腈为色谱纯，购自天津市康科德科技有限公司。

1.3 仪器

LC3000型高效液相色谱仪（北京创新通恒有限公司）；Agilent 1290 超高效液相色谱仪和Agilent 6540 Accurate-Mass Q-TOF 质谱仪（安捷伦科技有限公司）；Dr Flash Ⅱ型中压制备液相色谱仪（苏州利穗科技有限公司）；FA2004电子天平（上海精科实业有限公司）；METTLER TOLEDO XS105 DualRange分析天平（梅特勒-托利多上海公司）；R201型旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；KQ-100型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（天津市名利科学器材厂）；SHZ-D （III）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；毛细玻璃管（内径0.9～1.1 mm，长100 mm，华西医科大学仪器厂生产）；医用手术针、手术线（上海汉康医疗器械有限公司）。

2 方法

2.1 鬼箭锦鸡儿醇提物及其固相萃取

鬼箭锦鸡儿红色木部心材粉末1 kg用95%乙醇（料液比1∶3）浸泡20 h，过滤，取滤液储存。将药材残留物用95% 乙醇加热回流提取3次，每次1 h，合并滤液。再用50%乙醇按相同的方法提取，充分混匀所有滤液，用旋转蒸发仪将样品旋干。最终得到鬼箭锦鸡儿醇提物（TE）约200 g，提取率约为20%。将76.5 g TE干燥粉末采用中压制备液相色谱仪进行固相萃取，色谱柱为High Techsil column C18（100 mm×450 mm，30～50 μm），用10%，40%，65%，100% 甲醇依次洗脱，流速为100 mL・min-1，得到4个部分。其中40%甲醇洗脱后得到干燥粉末31.5 g，记为TE-1；65%甲醇洗脱后得到干燥粉末37.7 g，记为TE-2。

2.2 抗血栓作用研究

2.2.1 TE对大鼠下腔静脉血栓形成的作用 雄性SD大鼠35只，分为对照组[1%羟甲基纤维素钠CMC-Na），阿司匹林阳性组（100 mg・kg-1），TE低、中、高剂量组（分别为150，300，600 mg・kg-1）。阿司匹林及TE各剂量组药物事先均用1% CMC-Na混悬，连续灌胃给药7 d，每天1次，给药体积为10 mL・kg-1。末次给药2 h后，对大鼠腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉（350 mg・kg-1）。参照文献 [9] 建立大鼠下腔静脉血栓模型，6 h后重新打开腹腔，在距结扎处下方2 cm处夹闭下腔静脉。沿纵向剖开血管，取出血栓。用滤纸吸去多余血液，称量血栓湿重。

2.2.2 TE对小鼠急性肺血栓的作用 将小鼠随机分为6组，即正常组、模型组、阿司匹林组和TE低、中、高剂量组。正常组及模型组小鼠，灌胃给予1% CMC-Na，阿司匹林阳性组灌胃给予阿司匹林100 mg・kg-1，TE低、中、高剂量分别为200，400，800 mg・kg-1。阿司匹林以及药物TE均用1% CMC-Na混悬。小鼠连续灌胃给药10 d，每天1次。于末次给药2 h后，除正常组以外，其余各组小鼠尾静脉注射胶原蛋白（250 μg/只）和肾上腺素（9 μg/只）的混合溶液[10]。记录注射后5 min内每组小鼠死亡或偏瘫未恢复的只数，计算药物的保护率。

2.2.3 TE-1和TE-2对小鼠急性肺血栓的作用 将小鼠分为模型组、阿司匹林组、TE-1和TE-2低、中、高剂量组，给药剂量及操作方法同2.2.2项。分别计算TE-1和TE-2在低、中、高3个剂量时对小鼠的保护率。

2.2.4 出血时间的测定 将小鼠随机分为11组，每组10只，即对照组、阿司匹林阳性组和3种药物（TE，TE-1，TE-2）的低、中、高剂量组。给药剂量同2.2.2项，连续灌胃给药7 d，每天1次。于末次给药2 h后，在距小鼠尾尖5 mm处断尾，参照文献[11]方法测定小鼠尾出血时间。

2.2.5 凝血时间的测定 小鼠分组及灌胃给药方法同2.2.4项。于末次给药2 h后分别采用毛细管法和玻片法测定凝血时间[12]。

2.3 化学成分鉴定

2.3.1 混合对照品溶液的制备 精密称定对照品1～6（分别为0.97，0.94，1.07，0.96，0.96，1.05 mg），分别置于1mL量瓶中，用色谱甲醇加10～20 μL DMSO分别溶解、定容，制备对照品储备液。各取200 μL，混合，氮气吹干，加入色谱甲醇1 600 μL溶解，超声处理，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得混合对照品溶液。

2.3.2 TE中化学成分的鉴定 采用对照品加入法进行分析鉴定。精密称取TE 10.52 mg，用色谱甲醇定容至2 mL量瓶中，超声，过滤，进行HPLC分析。色谱条件如下：色谱柱为Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ column（4.6 mm×250 mm， 5 μm）以及Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ保护柱，柱温为35 ℃。流动相为0.1%乙酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱，洗脱程序为：0～15 min，5%～20% B；15～25 min，20% B；25～40 min，20%～25% B；40～65 min，25%～30% B；65～95 min，30%～60% B；95～100 min，60%～100% B；100～120 min，100% B。流速为1 mL・min-1，进样体积为10 μL；紫外检测器检测波长为270 nm。另取30 μL TE溶液，加入相同体积的2.3.1中所述混合对照品溶液，混合，氮气吹干，再用30 μL色谱甲醇溶解、超声，进样10 μL，色谱条件同TE。

2.3.3 TE经固相萃取后各部分的HPLC-UV分析 对总提物TE及固相萃取后得到的4个部分进行HPLC分析。方法同2.3.2。

2.3.4 TE-1与TE-2中化学成分的UPLC/DAD-q-TOF-MS分析 采用UPLC/DAD-q-TOF-MS对鬼箭锦鸡儿醇提物的2个主要部分（TE-1和TE-2）中所含化学成分进行在线鉴定。

色谱条件：Waters Cortecs C18色谱柱 （2.1 mm×100 mm，1.6 μm），柱温35 ℃，流动相为0.1% 乙酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱0～23 min，10%～15% B；23～35 min，15%～20% B；35～50 min，20%～25% B；50～65 min，25%～30% B；65～75 min，30%～60% B；75～85 min，60%～90% B；85～95 min，90% B。流速为0.3 mL・min-1。进样体积为2 μL。DAD作为检测器，检测波长为200～400 nm。

质谱条件：电离方式为ESI，正离子模式，扫描范围m/z 100～1 000，气体温度300 ℃，干燥氮气流速8.0 L・min-1，雾化器压力35 psi（1 psi=6.895 kPa），毛细管电压3 500 V，裂解电压175 V。数据分析软件为Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis Software B.06.00。

2.4 数据处理

数据采用IBM SPSS Statistics 20 软件进行统计分析，所有数据用±s表示，各组间数据比较采用单因素方差分析及LSD检验，P

3 结果

3.1 鬼箭锦鸡儿的抗血栓活性

3.1.1 大鼠下腔静脉血栓实验 与对照组相比，TE低、中、高剂量组均能够显著性减少下腔静脉血栓质量（P< 0.01），且随着TE剂量的增大，其抗血栓作用逐渐增强，见图1。TE在中剂量300 mg・kg-1给药时抑制血栓形成的作用与阿司匹林在100 mg・kg-1时相当，高剂量给药时显示出比阿司匹林100 mg・kg-1时更强的抑制血栓形成的作用（P< 0.01）。

3.1.2 TE对小鼠急性肺血栓的作用 对小鼠尾静脉注射胶原蛋白-肾上腺素后，小鼠会表现出不同的症状。轻者会出现行动迟缓，反应迟钝，几分钟后恢复；重者则会出现呼吸急促、心跳加速、瘫痪、翻跳、鼻孔有红色泡沫、死亡等症状。TE在胶原蛋白-肾上腺素诱导的小鼠急性肺血栓模型实验中能够发挥一定的保护作用，使小鼠免于死亡或者偏瘫。TE在低、中、高剂量时对小鼠急性肺血栓的保护率分别为33.3%，50%，58.3%，见表1。与模型组相比，阿司匹林组、TE-中、高剂量组具有显著性差异（P

3.1.3 TE-1和TE-2对小鼠急性肺血栓的作用 与模型组相比，阿司匹林组，TE-1的中、高剂量组和TE-2各剂量组均能够显著地保护小鼠免于偏瘫或死亡（P

3.1.4 TE，TE-1和TE-2对出血时间的影响 与对照组相比，阿司匹林组，TE中、高剂量组以及TE-1和TE-2的各剂量组均能显著延长尾出血时间（P

3.1.5 TE，TE-1和TE-2对凝血时间的影响 凝血时间采用玻片法和毛细管法同时测定。玻片法和毛细管法2种测定方法虽然数值稍有差异，但其变化趋势一致，见图4。与对照组相比，TE各剂量组以及TE-2的中、高剂量组在2种测试方法下均具有显著性差异（P

3.2 化学成分鉴定

3.2.1 TE中化学成分的鉴定 向鬼箭锦鸡儿总提物（TE）样品溶液中加入对照品混合溶液后，色谱峰1～6号峰高显著增加，说明总提物中对应位置分别为化合物5，7，4′-三羟基-3′-甲氧基异黄酮、7，4′-二羟基黄酮、7，2′-二羟基-6，4′-二甲氧基异黄酮、7，3′-二羟基-4′-甲氧基异黄酮、4′-羟基-6，7，3′-三甲氧基异黄酮和L-高丽槐素，见图5。

3.2.2 TE及其4个部分的HPLC-UV分析 TE经固相萃取后得到的4个部分之间交叉程度很小，说明TE中的化学成分在各个部分间得到了很好的分离，见图6。从图中可以看出，TE 中的成分主要集中分布在TE-1（C）和TE-2（D）中。由于图5，6中所采用的分析条件完全相同，由此可判断化合物2～6主要分布在TE-2中。

3.2.3 TE-1 和 TE-2的UPLC/DAD-q-TOF-MS 分析 为进一步了解TE-1和TE-2所含化学成分种类的差异，本实验采用UPLC/DAD-q-TOF-MS对TE-1和TE-2中各自所含有的主要化学成分类别进行了在线鉴定。通过优化条件，最终选择在正离子模式下进行检测，见图7。基于保留时间，UV吸收特征，二级质谱碎片信息以及相对质量偏差小于5，对TE-1和TE-2中的25个主要色谱峰进行了鉴定，结果及相应质谱和紫外光谱数据见表3。在进行鉴定的25个色谱峰中，有14个异黄酮类、4个类、3个紫檀素类、2个黄酮类化合物、 1个二氢黄酮醇类和1个苯丙酸类化合物。其中黄酮类化合物占20种，是主要的化学成分类别。

4 讨论

血栓作为心脑血管系统疾病发病的主要因素之一，严重地影响了人类的身体健康。尽管用于预防和治疗血栓的药物有很多种，但大多均有较强的副作用。中药以其副作用小，疗效好等优点引起广泛关注。中医将血栓归为血瘀证，常用活血化瘀法治疗。鬼箭锦鸡儿被藏医用作活血化瘀药已有多年的应用历史，但目前尚未见到关于其体内抗血栓活性的药理研究，本实验首次从抗血栓角度研究其活血化瘀作用。实验过程中大（小）鼠的给药剂量通过预实验确定。

本实验通过建立大鼠下腔静脉血栓和小鼠急性肺血栓2种血栓模型考察TE的抗血栓作用，实验结果表明，TE在下腔静脉血栓模型中显示出良好的抗血栓活性，能够显著性降低血栓质量（P

为进一步探究其抗血栓的活性部位，本实验采用固相萃取得到鬼箭锦鸡儿醇提物的2个主要部分TE-1和TE-2。另外的2部分因量少，不足以用于药理实验研究。在急性肺血栓实验中，如表2所示，相同给药剂量时TE-2对小鼠的保护率均高于TE-1。结合表1中数据，3种药物对小鼠的保护率由弱到强依次为TE-1

实验中通过对照品对照结合液相色谱-质谱分析对提取物中所含6种主要成分及其他成分的种类或类别进行了鉴定。采用对照品加入法鉴定了TE中的6个主要化学成分；为比较TE-1与TE-2中所含化学成分种类的差异，采用UPLC-DAD-q-TOF- MS技术，对其中的25个化学成分进行了鉴定。结合图7和表3所示结果，TE-2中含有13个异黄酮类化合物，3个紫檀素类化合物，2个黄酮类化合物和1个类化合物；而TE-1中含有1个二氢黄酮醇类化合物，1个异黄酮类化合物，1个苯丙酸类化合物和3个类化合物。可见TE-1中主要为类成分，而TE-2中主要为异黄酮类和紫檀素类成分，综合急性肺血栓、出血时间和凝血时间实验结果，提示类、异黄酮类和紫檀素类可能均为鬼箭锦鸡儿抗血栓的活性成分；TE-2较TE-1显示出更强的抗血栓活性，由此判断异黄酮类和紫檀素类成分可能是鬼箭锦鸡儿抗血栓的主要活性成分。

综上所述，鬼箭锦鸡儿醇提物具有显著的抗血栓形成作用，其抗血栓活性可能是通过抑制血小板聚集和作用于凝血系统而发挥作用，TE-1和TE-2是其抗血栓的2个有效部位，且TE-2部分活性强于TE-1。因此，对其所含主要成分异黄酮类和紫檀素类进一步开展抗血栓作用机制研究对于阐释鬼箭锦鸡儿的抗血栓作用、临床用药及进一步开发具有重要意义。

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