散发帕金森病LRRK2基因G2019S的突变研究

摘要：目的：研究中国粤西地区散发性帕金森病患者LRRK2基因G2019S突变情况。方法：应用聚合酶链反应（ PCR）扩增LRRK2基因41号外显子序列，反应产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后用银染法染色。对样本进行DNA双向测序。结果：在71例散发性帕金森病患者中未发现LRRK2基因41号外显子G2019S突变。结论：G2019S突变可能不是中国粤西地区散发性帕金森病的突变位点。

关键词：散发性帕金森病；LRRK2基因；基因测序

帕金森病（Parkinson's Disease， PD）是常见的、慢性致残性神经系统变性疾病，在亚洲人群中，其年发病率为1.5/100000～15/100000[1]。临床主要表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿势反射障碍。研究证实，PD是遗传因素和环境因素共同作用的结果。目前已克隆出a-synuclein、UCHL1、LRRK2、NR4A2、park1、DJ-1、parkin等与帕金森病发病相关的基因。在所有已确定的PD基因中，Lrrk2基因是最有可能在典型晚期发病的PD中起作用的基因[2， 3]。我们对收集的中国粤西地区散发PD患者进行研究，筛查是否存在LRRK2基因G2019S突变。

1 对像与方法

1.1研究对象

71例散发帕金森病患者，均为广东医学院神经内科收集病例，诊断符合帕金森病诊断标准断[4]， 并排除非帕金森病的诊断。71例患者，男44例，女27例，年龄46～87岁，平均65.5±8.5岁。

1.2研究方法

所有患者均取晨起肘静脉血5-10ml （3.8%柠檬酸钠抗凝），常规碘化钾法从白细胞中提取基因组DNA，-20°C保存。

聚合酶链反应（ PCR）扩增LRRK2基因41号外显子序列，引物正义序列：5’-GCACAGAATTTTTGATGCTTG-3’，反义序列：5’-GAGGTCA GTGGTTATCCATCC-3’，引物由上海生工公司合成。PCR扩增采用12.5ul反应体系，其中包括10×Buffer1.0ul，dNTP（10 mmol /L）1.0ul，引物（20umol/L）0.3ul， 基因组DNA1.0ul，TaqDNA聚合酶（5u/μ1） 0.15ul，H2O 9.05μ1。PCR 反应条件：95℃，热变性5 min，（95℃，30s，退火62℃，35s，延伸72℃，40s）扩增32个循环后延伸72℃，10 min，终止反应。反应产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAG）电泳。100V电泳2 h以后用银染法染色，观察结果。

DNA测序，分别对每例样本进行双向测序，测序由上海生工公司完成。

2 结果

71例帕金森病患者的DNA模板，经PCR扩增得到331bp的产物（电泳结果见图1），测序结果经序列对比后未发现LRRK2基因41号外显子G2019S突变（测序结果见图2）。

3 讨论

本研究利用聚合酶链反应（ PCR）扩增71例帕金森病患者的DNA LRRK2基因41号外显子序列，并对其扩增得到的产物进行测序，结果未发现LRRK2基因41号外显子G2019S突变，提示G2019S突变可能不是中国散发帕金森病的突变位点。

Lrrk2基因位于染色体12q11.2- q13.1，全长7584个碱基， 其产物称为Lrrk2蛋白，也叫dardarin蛋白，是Paisan[5]等于2004年首先发现，由51个外显子构成，共有2527个氨基酸，富含亮氨酸重复序列。Lrrk2蛋白属于Roco （Ras of complex proteins （Roc） with a C-terminal of Roc domain）蛋白家族中的Ras/GTPase超家族，包括富含亮氨酸的重复单位区（leucine-rich repeat zone，Lrr）、复合蛋白激酶（ROC）、C末端Roc域（COR）、微管相关蛋白激酶激酶激酶（microtubuleassociated protein kinase kinase kinase，MAPKKK）和C末端β螺旋形重复（WD40）五个连续的结构[6]。Lrrk2蛋白是一个具有多种功能的激酶，通过添加磷酸到其它蛋白上从而激活这些蛋白的活性。目前，在Lrrk2蛋白上至少发现了75个氨基酸置换，但发现有致病性的只有R1441C， R1441G、Y1699C、G2019S、I2020T 、R1628P和G2385R。体外研究发现，Lrrk2突变会解除激酶活性抑制，诱导神经元轴突和分支的顺行性退化，tau蛋白过度磷酸化，导致神经元细胞程序性死亡。而且，把Lrrk2突变体引入到成年大鼠脑中，也可以发现类似体外培养的情况：该突变体阻止多巴胺神经元生长及诱导产生包涵体[7， 8]。位于41号外显子的G2019S突变改变LRRK2蛋白的自身磷酸化，进一步增强底物磷酸化水平，从而导致 LRRK2的激酶活性增强产生疾病。Lrrk2突变还可以引起多种神经病理改变，在G2019S突变的大鼠模型中，表现出黑质多巴胺神经元的进行性变性[9]；没有Lewy小体的单纯的黑质神经元的丢失；α-突触白阳性的Lewy小体的黑质神经元的丢失[10]；与tau蛋白病变相关的神经纤维缠结的出现[11]；通过激活GSK3β，使tau蛋白错配及磷酸化，从而诱导神经元树突变性11。这些病理改变都可能促进PD的发生。在G2019S突变PD患者身上，可以见到线粒体功能及形态明显受损，但目前尚不清楚这些改变是否与G2019S突变后Lrrk2的活性改变有关[12]。

在北非阿拉伯人中，41%（20/49） 散发性PD病人携带G2019S突变，37%（10/27） 家族性PD病人携带G2019S突变，而在欧洲人群中，散发性PD病人携带G2019S突变为1.9%，家族性为2.9%[13]。而在北美高加索人群中，家族性和散发性分别约为3%～7%和1%～2%[3， 14， 15] 。然而，G2019S突变在亚洲人群中罕见。在印度学者的研究中，他们调查了印度150名散发性帕金森病病人和170名对照者，未发现有G2019S突变16。国内学者曹立在136名散发及家族性PD患者标本中均未发现G2019S突变[17]。以上结果说明G2019S突变在不同的种族和地域中有非常大的差异。需要注意的是，在携带有LRRK2 G2019S突变的帕金森病人中，该基因的外显率是随年龄变化的，即具有年龄依赖的特点：60岁时外显率为15%，70岁时外显率为21%，到了80岁外显率可以达到32%[18]。本实验研究的71例散发的帕金森病患者中均未发现G2019S突变，可能由于种族和地域差异该突变位点在中国帕金森病患者中少见甚至缺如，提示G2019S突变可能不是中国散发帕金森病的突变热点。由于本实验只涉及到散发帕金森病例，且样本量较少，实验结果具有局限性，我们正在收集更多样本及家族性帕金森病例样本，更近一步的研究工作正在进行中。

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