Y染色体微缺失与发生的相关性分析

【前言】Y染色体微缺失与发生的相关性分析由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。【Abstract】 Objectives: To explore the relationship between AZF microdeletions in Y chromosomal and male spermatogenesis. Methods: The study recruited 1021 infertile Chinese men, including 343 men of azoospermia (177 with nearly normal spermatogen...

【摘 要】 目的:探讨Y染色体AZF微缺失与男性发生之间的关系。方法:采用聚合酶链反应技术对343例无症（包括发生基本正常177例和生精障碍166例）、633例严重少精症、45例严重弱精症患者进行AZFa、AZFb、AZFc等3个区域微缺失分析。结果:166例生精障碍患者中发现AZF微缺失41例,总缺失率为24.7%；177例生精基本正常的男性发现3例合并AZFc的微缺失，缺失率为1.7%；在严重少精组发现AZF微缺失49例,总缺失率为7.7%；弱精症患者无一例发现AZF微缺失。生精障碍组与其他男性比较Y染色体AZF区域微缺失率差异有统计学意义(P

【关键词】 男性不育; Y染色体; 无因子; 微缺失

Microdeletions of AZF in Y chromosome and spermatogenesis failure in infertile men

ZHANG Qiufang, CHANG Liang, ZHAO Nan, SHAO Minjie, GAO Xuefeng, QIAO Jie, JIANG Hui

Center of Reproduction Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology,The Third Hospital of Peking University, Beijing 100083, China

【Abstract】 Objectives: To explore the relationship between AZF microdeletions in Y chromosomal and male spermatogenesis. Methods: The study recruited 1021 infertile Chinese men, including 343 men of azoospermia (177 with nearly normal spermatogenesis in tests and 166 cases with maturation arrest in tests), 633 men of oligozoospermia and 45 men of asthenospermia. Y chromosomal microdeletions in AZFa, b, c regions were screened with a multiplex polymerase chain reaction (PCR). Results: In azoospermia patients, 41 (24.7%) cases with Y chromosomal microdeletions were found with spermatogenesis failure, while 3 cases were found to have normal spermatogenesis. There were 49 cases with AZF microdeletions found in oligozoospermics. No case was found in asthenospermics. There was a significant difference in Y chromosomal microdeletions between the patients with spermatogenesis failure and other infertile men (P

【Key words】 Male infertility; Y chromosome; Azoospermia factor; Microdeletion

Y染色体不仅是性别决定的关键因素，也在人类发生过程中发挥重要作用。近年来研究已经证实，Y染色体无因子（azoospermia factor，AZF）[1,2]微缺失是不育男性患者的重要遗传因素之一，包括Y染色体长臂（Yq）AZFa、AZFb和AZFc三个区域，当这些区域中的一个或多个部位出现缺失时将导致发生障碍，造成少、弱精症甚至无症，最终导致患者不育。国外研究报道，少症和无症患者约有8.2%的Y染色体微缺失率。国内也有相似发病率的报道。另外，由于Y染色体微缺失可能通过某些辅助生殖方式如卵泡浆内单注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）传给后代。因此，检测Y微缺失已成为各生殖中心的常规检测项目。本研究利用商品化的试剂盒对1021例不育患者进行了Y染色体微缺失的筛查分析,来探讨男性不育与Y染色体微缺失之间的相关性。

1 对象与方法

1. 1研究对象

2010年1月~2011年8月在北医三院生殖中心就诊的男性不育患者（汉族），排除急慢性感染、抗抗体阳性、外伤、手术、化疗等医源性原因以及其他染色体异常等原因造成的不育。根据WHO的分析标准，病人被分为4类：343例无精症(包括生精障碍组166例，即连续三次检测未见，活检组织的病理提示为生精细胞显著减少，偶见或未见者；生精基本正常组177例,即连续三次检测未见，但活检可见正常的生精现象，并能见到成熟者；或者是组织中生精现象减少，但可以见到成熟)；633例少精症(密度

1. 2主要试剂

外周血基因组DNA提取盒、Y微缺失（Y6 PCR）试剂盒均购自上海透景生命科技有限公司。该试剂盒根据欧洲生殖协会推荐标准进行引物设计，运用多重PCR技术快速检测Y染色体AZF基因家族AZFa、AZFb和AZFc三个区域中的6个序列标签位点（sequence tagged sites， STS）微缺失。每份样品需做A组和B组两个多重PCR反应，A组包括AZFa区内的sY86（产物155bp），AZFb区内的sY127（产物274bp）及AZFc区内的sY254（产物400bp），B组包括AZFa区内的sY84（产物255bp），AZFb区内的sY134（产物301bp）及AZFc区内的sY255（产物126bp）。另外，每组设置一对扩增SRY基因的引物作为内对照（产物472bp）；并且为了确保结果的可靠性，用正常生育男性与女性血样及蒸馏水作为对照。

1. 3 PCR

1.3.1 DNA提取 根据外周血基因组DNA提取盒的说明，提取人外周血基因组DNA。取500μl抗凝静脉血，用酚/氯仿/异戊醇抽提，最后用乙醇沉淀，-20℃保存备用。

1.3.2 PCR扩增 25μl体系，包括10×buffer 2.5μl，25 mmol/L MgCl2 1.5μl，10 mmol/L dNTP 2.5μl，DNA 3μl（50-100ng），引物混合物A或B 2μl，蒸馏水13μl和Taq DNA聚合酶0.5μl。PCR反应条件为：95℃ 5min预变性；95℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s,共35个循环；72℃延伸10min。PCR产物4℃保存。每份标本重复PCR一次。

1.3.3 电泳检测及结果判断 取PCR产物8μl加入1.5μl 6×上样缓冲液(含EB的替代染料subgreen)，混匀后点样于3.0 g/L琼脂糖凝胶，6V/cm电泳30min。用DL2000 Marker作为参照。结果判断：如果与正常对照组相比出现一个或多个STS条带丢失，即可判断为其对应的STS缺失。每份标本重复PCR、电泳一次。

2 结 果

病人资料利用单因素方差分析，各组在年龄上没有统计学差异。见表1。

PCR扩增结果。在177例伴有生精基本正常的无精症患者中,3例有AZFc区缺失，总缺失率为1.7%；在166例伴有生精障碍的无精症组中，1例有AZFa区缺失，2例有AZFb区缺失，29例有AZFc区缺失，7例AZFb区合并AZFc区缺失，2例AZFa、AZFb和AZFc全部缺失，总缺失率为24.7%。在633例严重少症患者中,1例AZFa区缺失，48例有AZFc区缺失，1例AZFb区合并AZFc区缺失，总缺失率为7.7%。在45例弱精症患者中，无一例发生Y微缺失。见表2

3讨 论

自从发现AZF基因与发生相关后，国内外实验室均有关于Y微缺失在少弱精、无精症、畸精症等中的作用研究，结果提示其发生率波动大。国内多家中心也有关于少精症、无精症中Y微缺失发生率的报道，结果具有明显的变异[3~5]。同时，由于各实验室研究选择的STS位点3～15个不等，使得结果之间无法进行比较分析。Simoni等人提出了最小检测体系,即每个区域选取2个STS进行检测，主要包括AZFa区的sY84和sY86，AZFb区的sY127和sY134，AZFc区的sY254和sY255。目前,由于这6个位点的重复性较好，能检测出AZF 3个亚区内超过90%的缺失，因此被欧美多家生殖医学实验室采用。本研究就是应用上述6个序列标签位点来检测Y微缺失与发生障碍之间的相关性。

本研究中，将无精症患者按照活检的病理特点给予分组，包括生精基本正常组和生精障碍组，结果提示其中在发生基本正常组，Y微缺失的总发生率仅有1.7%，明显低于少弱精组；而在生精障碍组Y微缺失的总发生率高达24.7%，明显高于其他各中心的报道；而少弱精组Y微缺失的总发生率为7.7%，与文献报道一致。从结果可以发现，Y微缺失在少弱精患者中的发生率与其他中心的报道基本相似；而在无精症组出现明显的差异。因此，该研究提示，造成Y微缺失发生率报道各异的一个主要原因就是研究对象的选择标准。本研究中病例筛选比较严格，患者有明确的腮腺炎病史、其他染色体异常等，即使这些患者活检提示生精障碍，也不纳入生精障碍组。经过严格筛选后，Y微缺失的检出率在各组间出现了明显差异，其中在生精障碍组其发生率远远高于其他各组，这结果证实Y微缺失与发生有着明显的相关性。

研究显示，AZF区不同亚区的缺失与不同程度的生精障碍有关[6]。AZFa的缺失较罕见,该区缺失可导致少症和唯支持细胞综合征(sertoli cell only sydrome, SCOS)[7]；AZFb微缺失会导致成熟阻滞（Maturation arrest, MA）。本研究中，共有3例发生AZFa的缺失，活检病理均提示，生精细胞基本消失，未见。AZFb缺失会导致发育停滞于精原细胞阶段。Krausy等研究发现完全性AZFb缺失患者内无成熟。本研究中在生精障碍组有2例合并AZFb微缺失，这两个患者活检病理提示，生精细胞显著减少，未见；但在少精症组也发现1例，该患者多次检查无，但是偶尔检查中会偶见。AZFc区缺失频率最高,占Y染色体微缺失的9%～30%。本研究中AZF的主要缺失类型亦为AZFc区，患者主要表现为极度少症（7.6%，48/633）和无症（17.5%,29/166）。另外，本研究中发现8例AZFb合并AZFc微缺失，其中仅1例为少弱精患者，7例均为生精障碍的患者。因此，本研究结果证实，Y微缺失是男性生精障碍的一种重要原因。有研究认为，Y微缺失患者的辅助生育结果与其他男性患者并没有明显的差异[8]。因此，该作者认为微缺失的患者是否需要进行胚胎植入前遗传学诊断( PGD)应该主要听从患者夫妇的意愿。但是，这有一定的局限性。ICSI技术能垂直传递这种异常[9]，因此Y微缺失对后代的影响还需要更深入的研究，是否需要进行PGD应该综合考虑多种因素才能决定。

另外，究竟是什么原因造成Y染色体微缺失的，目前还没有明确的定论。但是，日益严重的环境污染被认为是重要原因之一。因为，男性生殖系统中，生殖细胞在分化与成熟的过程中，环境污染会破坏DNA，引起DNA的突变。Khan等人的研究发现[10]，携带Y微缺失的无精症或者少弱精患者的中hexachlorocyclohexane(HCH) and its isomers水平明显高于其他研究对象。结果提示，质量是与HCH密切相关的。HCH是发生障碍过程DNA发生突变的潜在的重要的危险因素。但是，其中的作用机制还需要进一步更深入研究。

综上所述，对于少精症、无精症患者，进行Y微缺失筛选有重要的临床意义。尤其是对于合并有AZFc区缺失的患者，应尽早给予助孕治疗，以预防随着年龄的增长发生逐渐下降。

参考文献

1 Vogt P.H. Genetics of idiopathic male infertility: Y chromosomal azoospermia factors (AZFa, AZFb, AZFc)[J]. Baillière’s Clinical Obstetrics and Gynaecology, 1997,11(4):773-795.

2 Alia S, Hasnain SE. Genomics of the human Y-chromosome 1. Association with male infertility[J]. Gene,2003,321:25-37.

3 A Zhou-Cun, Yang Y, Zhang SZ, et al. Chromosomal Abnormality and Y Chromosome Microdeletion in Chinese Patients with Azoospermia or Severe Oligozoospermia[J]. Acta Genetica Sinica, 2006, 33(2): 111-116.

4 Lin YM, Chen CW, Sun HS, et al. Y-chromosome microdeletion and its effect on reproductive decesions in Taiwanese patients presenting with nonobstructive azoospermia[J]. Urology,2000,56(6):1041-1046.

5 郑红云, 李艳, 童永清. 200 例男性不育患者的Y 染色体微缺失检测[J]. 中国优生与遗传杂志,2011,19(7):42-43.

6 Fujisawa M, Shirakawa T, Kanzaki M, et al. Y-chromosome microdeletion and phenotype in cytogenetically normal men with idiopathic azoospermia[J]. Fertil Steril, 2001,76(3):491-495.

7 Fujisawa M, Shirakawa T, Kanzaki M, et al. Y-chromosome microdeletion and phenotype in cytogenetically normal men with idiopathic azoospermia[J]. Fertil Steril,2001,76(3):491-495.

8 吴畏，周作民，林敏，等. Y 染色体微缺失患者与无或严重少弱症患者ICSI 治疗结局比较[J]. 中华男科学杂志,2011,17(9) :771-774.

9 Cram DS, Ma K, Bhasin S, et al. Y chromosome analysis of in fertile men and their sons conceived through in tracytoplasmic sperm injection: vertical transmission of deletions and rarity of de novo deletions[J]. Fertil Steril,2000,74(5): 909- 911.

10 Khan FH, Ganesan P, Kumar S. Y Chromosome microdeletion and altered sperm quality in human males with high concentration of seminal hexachlorocyclohexane (HCH)[J]. Chemosphere,2010,80:972-977.

［收稿日期：2011-12-22］