促红细胞生成素对脓毒症大鼠心肌损伤的保护作用

【摘要】目的 探讨促红细胞生成素（EPO）对脓毒症大鼠心肌损伤的保护作用及其机制。方法 通过盲肠结扎穿孔引流术（CLP）建立脓毒症大鼠模型。健康SD大鼠96只，随机（随机数字法）分为3组：假手术组（Sham组，n=32）、脓毒症组（CLP组，n=32）、EPO组（n=32，脓毒症模型基础上EPO 1000 IU/kg 腹腔内注射）。分别于造模术后3、6、12、24 h记录心脏血流动力学指标变化，测定血清炎症反应因子水平及心肌酶变化，应用流式细胞仪检测心肌细胞线粒体膜电位、心肌细胞凋亡及心肌组织核因子-κB（NF-κB p65）表达水平；光镜下观察大鼠心肌细胞的病理学变化。所有数据以均数±标准差（x±s）表示，采用 SPSS 13.0统计软件分析，组间比较采用t检验，以P

【关键词】脓毒症；心肌损伤；凋亡；促红细胞生成素；线粒体细胞膜电位；核转录因子；炎症因子；大鼠

The mechanisms of protective effects of erythropoietin （EPO） on sepsis induced myocardial injury in rat.Qin Yanjun， Zhang Xinliang，Yu Yueqing， Bian Xiaohua， Dong Shimin. Department of Emergency， The Third Hospital of Hebei Medical University， Shijiazhuang 050051， China

Corrseponding author：Dong Shi-min， Email：

【Abstract】Objective To investigate the protective effects of erythropoietin （EPO） on myocardium injury after sepsis in rats in order to clarify the mechanisms.

Methods The rat models of sepsis were produced by cecal ligation and perforation method（CLP）. Ninty-six healthy SD rats were randomly （random number） divided into 3 groups： the sham operation group （Sham group， n=32）， the sepsis group （CLP group， n=32）， and the EPO treatment group （EPO group， n=32） treated with EPO 1000 IU/kg intraperitoneal injection after the CLP. The observation intervals were set at 3 h， 6 h， 12 h and 24 h after the surgery.The cardiac hemodynamics of the CLP group were measured. Plasma levels of inflammatory factors and myocardial enzyme indicators were determined by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）； Membrane potential levels of chondriosome of myocardial cells， cell apoptosis rates and expressions of nuclear factor-κB p65 of myocardium tissue were detected by flow cytometer； Then the pathological change of myocardium with HE staining was observed under light microscopy.

Results （1） Compared with the CLP group， left ventricle systolic pressure （LVSP）， left ventricle diastolic end pressure （LVEDP）， the maximum rate of left ventricle rise and fall （+dp/dtmax and - dp/dtmax） in the EPO group improved （P

Conclusions EPO may increase membrane potential levels of chondriosome and decrease the apoptosis rates of myocardial cell in rats after sepsis， and it may reduced the production of inflammatory factors to protect the myocardial cell by down-regulating NF-κB p65. Both increased membrane potential level of chonriosome and decreased inflammatory factor may implicate in myocardium protection thereby improving cardiac function after sepsis.

【Key words】Sepsis； Myocardial injury； Apoptosis； Chondriosome membrane potential； Nuclear factor κB p65； Erythropoietin； Inflammatory cytokines； Rat

严重脓毒症时心肌抑制发生率达80%，伴有明显心肌抑制达40%，是影响预后的重要因素[1]。虽然正性肌力药物可提高射血分数，但因增加心肌耗氧量，其净效益并不肯定。目前尚无有效改善心肌抑制的方法，因此急需寻找新的治疗途径和方法。EPO对心肌的作用是近年新的研究热点， 研究表明EPO可直接作用于心肌细胞，对心血管系统有保护作用[2]。进来有研究显示EPO对动物脓毒症有保护作用[3]，但对脓毒症心肌抑制或心肌损伤的影响尚未见报道。本研究拟建立脓毒症大鼠心肌损伤模型，并进行EPO干预，试从病生理学特性方面，探讨EPO对脓毒症心肌损伤的保护作用，为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料和仪器

健康雄性SD大鼠（210-250克），河北医科大学实验动物中心提供；Epics-XLⅡ型流式细胞仪，美国Beckman Coulter公司；注射用重组人促红素，上海凯茂生物医药有限公司；水合氯醛，天津市科密欧化学试剂开发中心；AnnexinV-FITC/PI Apoptosis试剂盒， 美国Pharmagen公司；兔抗大鼠NF-κB p65抗体，美国Cell singnaling公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体，美国Santa Cruz公司；罗丹明123，美国Sigma公司；大鼠IL-6、IL-10、TNF-α ELISA试剂盒上海朗卡公司进口分装；大鼠心肌钙蛋白I（cTNI）、乳酸脱氢酶（LDH）、谷草转氨酶（AST）、肌酸激酶（CK）、C反应蛋白（CRP）ELISA试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 动物模型分组

96只健康SD大鼠，清洁级，雄性，按清洁级大鼠的要求饲养，自由进食水。随机原则（随机数字表）分3组：脓毒症组（CLP组n=32）、EPO干预组（EPO组n=32）和假手术组（sham组n=32）。

1.3 脓毒症动物模型的建立

按文献[4]报道的方法行盲肠结扎穿孔术（CLP）复制脓毒症动物模型。以10%水合氯醛（0.03 mL/kg）皮下注射麻醉后固定、铺无菌洞巾。沿腹正中线作约1.5 cm切口，找到盲肠，在盲肠根部约1.5 cm结扎盲肠，避免结扎回肠及盲肠系膜血管。用18号针穿刺盲肠3次，并留置一橡皮引流条以防止针孔闭合，挤压盲肠致有粪便溢出，形成盲肠漏。之后，将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁切口。EPO组于模型复制后立即腹腔内注射EPO 1000 U/kg。Sham组打开腹腔找到盲肠后缝合腹壁切口，盲肠不作穿刺。

1.4 脓毒症动物模型的确认

两组实验动物均术后很快苏醒。造模术后小鼠出现精神萎靡、嗜睡、反应迟钝、活动差、怕冷、聚居、竖毛、厌食、眼角分泌物增多等表现。CLP组大鼠打开腹腔肉眼可见小肠浆膜面出现大量的脓性渗出物，多脏器病理切片可见组织细胞结构改变和不同程度的炎细胞浸润，如肺泡腔内见炎性渗出物及脱落的肺泡上皮、肝细胞灶性坏死伴炎细胞浸润，而对照组多脏器病理切片不见或少见异常。符合脓毒症动物模型标准[4]。

1.5 样本采集及观察指标

1.5.1 心脏血流动力学指标 造模术后大鼠用10%水合氯醛（0.03 mL/kg）的腹腔注射麻醉后，分离出右侧颈总动脉后插入导管，用多道生理记录仪测量左室收缩压（LVSP）、左室舒张末压（LVEDP）、左室压力上升最大速度（+dp/dtmax）、左室压力下降最大速度（- dp/dtmax）的血流动力学参数。

1.5.2 大鼠血清制备与贮存 自下腔静脉取血5 mL，其中2.5 mL血置于含有肝素钠抗凝管中，混匀后置于4 ℃冰箱保存，待行血浆肌钙蛋白I（cTNI）、血浆心室利钠肽（BNP）检测。剩余血标本室温静置2 h后离心制备血清，置于-70 ℃低温冰箱保存，待行血清肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-6、10（IL-6、IL-10）、C反应蛋白（CRP）、谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）。均用 ELISA法检测，按试剂说明书操作。

1.5.3 单细胞悬液的制备 将新鲜的心肌组织放在120目不锈钢网上，下置一平皿，用眼科剪刀将组织剪碎，用眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，直至将组织搓完为止。将平皿中的混悬液用300目铜网过滤去除细胞团块，收集细胞悬液，以 500～800 r/min离心沉淀2 min，收集沉淀物即为单细胞悬液，除掉上清液，尽量不残留PBS，并调整其浓度为1×106/mL。

1.5.4 心肌细胞凋亡检测 取100 μL 的细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V/FITC和10 μL 的PI（20 μg/mL），摇匀后于室温避光反应15 min，在反应管中加入500 μL Buffer液，待流式细胞仪分析。

1.5.5 心肌线粒体膜电位检测 取1×106/mL单细胞悬液0.1 mL，加入罗丹明123 100 μL ，避光、室温孵育30 min，加入PBS10 mL洗涤一次，弃上清液，待流式细胞仪分析。

1.5.6 心肌NF-κB p65 检测 取单细胞悬液1×106/mL 0.1 mL，加入兔抗鼠单克隆抗体NF-κB p65 100 μL，避光、室温孵育30 min，加入PBS10 mL洗涤一次，弃上清液，加入羊抗兔FITC-IgG二抗工作液100 μL ，避光、室温孵育30 min，加入PBS 10 mL离心同上，弃上清以除去未结合的荧光二抗，上机检测前加入PBS0.1 mL经500目铜网过滤后上机检测。在对蛋白免疫荧光标记物测定时，设一抗或二抗的本底对照和阴性对照。待流式细胞仪分析。

1.5.7 大鼠组织光镜切片的制作 常规蜡块的制作HE染色，光镜下观察并照相。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件包进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间差异以成组t检验或单向方差分析（ANOVA）进行分析，以P

2 结果

2.1 实验动物术后一般情况及各组7 d存活率

实验动物术后均很快苏醒，保持自身清洁。所有脓毒症组（CLP组）及EPO干预组（EPO组）出现心率、呼吸显著加快，体温明显上升，精神反应差，嗜睡，不思饮食，竖毛，腹泻等状态，出现出血或出血倾向。假手术组（Sham组）术后3 h左右恢复至正常状态，正常活动、进食、进水。Sham组、CLP组及EPO组7 d存活率分别为75%，30%和50%。

2.2 大鼠不同时间点心脏血流动力学指标的比较

与Sham组对应时相比较，CLP组大鼠术后出现LVSP，+dp/dtmax和-dp/dtmax指标下降，LVEDP上升（P

2.3 大鼠炎症反应指标的比较

与Sham组对应时相比较，CLP组CRP、TNF-α、 IL-6、IL-10水平均明显升高（P

2.4 大鼠心肌酶学指标的比较

CLP组cTNI水平在造模后12 h达峰值，较Sham组升高约6100倍，且各时间点均显著高于Sham组 （P

2.6 大鼠线粒体膜电位指标的比较

与Sham组相比，CLP组心肌细胞荧光峰明显左移，即线粒体膜电位明显降低， （P

2.7 大鼠心脏组织中NF-κB p65的表达量的比较

与Sham组相比， CLP组心肌组织NF-κB p65表达于术后24 h明显升高（P

2.8 心脏病理切片

光镜下观察大鼠心脏的形态学变化： Sham组：心肌结构清晰，心肌纤维排列整齐，横纹清晰，结构正常。CLP组：可见心肌细胞水肿显著，出现广泛的心肌小灶性出血及坏死，并有大量有炎性细胞侵润。EPO组：心肌观察到心肌纤维呈波浪状排列，有炎性细胞浸润。

3 讨论

脓毒症存在着心肌损伤和心肌抑制，严重脓毒症时有40%～50%的患者合并心脏功能不全，也是难治性低血压的重要机制之一，对脓毒症、MODS的预后有着重要影响[5]。本研究显示，脓毒症模型大鼠存在严重的心肌损伤、心功能下降，心肌细胞功能异常，应用EPO可以阻抑这种病生理状态，改善心脏功能。

本研究发现应用EPO可明显提高LVSP、降低LVDP以及升高±dp/dtmax，表明其具有显著改善血流动力学的作用。心肌肌钙蛋白-I（cTNI）目前被认为是反映心肌损伤程度高敏感高特异的“金标准”[6-7]。在本研究中脓毒症状态下cTNI显著增高，在12 h达到高峰，以后有所下降，但仍然显著高于正常值，说明脓毒症状态下存在明显的持续性心肌损伤，在应用EPO干预后，cTNI的水平显著下降，提示EPO对脓毒症大鼠心肌损伤具有保护作用。本实验同时观察心肌酶学改变，也同样证实脓毒症时应用EPO干预后，能明显地降低各种心肌酶，提示心肌损伤减轻。另外心肌细胞病理光镜下观察亦证实EPO可减轻心肌细胞水肿，改善肌纤维结构排列以及炎症反应。

研究表明，脓毒症时炎症反应，是引起心肌损伤的重要因素，炎症因子被看作是“心肌抑制因子”。目前已确认的促炎细胞因子主要有TNF-α、IL-6和IL-8等[8- 9]。本研究中CLP组大鼠血清CRP 、TNF-α、IL-6水平明显升高，而EPO干预组这些促炎因子明显降低，抗炎因子IL-10明显上调，表明EPO具有显著的抗炎症反应作用。核转录因子是炎症介质生成的关键因素，本研究中，笔者通过测定NF-κB P65蛋白表达反映NF-κB活化程度，结果显示，应用EPO干预后， NF-κB P65蛋白表达减少，提示EPO可能通过抑制NF-κB活化，使其下游的炎症介质的表达减少，减轻了脓毒症大鼠心脏组织的炎症损伤。这种作用可能是EPO心肌保护作用的重要机制之一。

脓毒症时免疫细胞和组织细胞的凋亡发生异常，与病程和预后密切相关，同时纠正凋亡异常的治疗措施逐渐发展，并且在动物实验中也取得了很好的疗[10-11]。本研究采用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果显示，脓毒症损伤24 h后，EPO组、CLP组心脏细胞早期凋亡率、晚期凋亡率较Sham组均显著升高，其中EPO组的细胞早期凋亡率在损伤后低于CLP组，差异显著。这些结果提示EPO可以抑制脓毒症后心肌细胞凋亡，给予外源性EPO能减轻因脓毒症损伤所导致的心肌细胞凋亡[12-13]。

正常的线粒体跨膜电位是维持线粒体进行氧化磷酸化、产生三磷酸腺苷的先决条件，是保持线粒体功能所必需的。线粒体跨膜电位的降低是细胞凋亡早期的不可逆事件[14-15]。本研究采用流式细胞术检测了三组实验动物线粒体膜电位的变化。研究结果证实，脓毒症时脏器细胞线粒体功能变化，线粒体膜电位降低；在应用EPO干预后，即EPO组与CLP组比较，大鼠的心脏细胞荧光峰明显右移，即荧光强度高的细胞增多，说明明显阻抑线粒体膜电位降低，从而抑制了细胞凋亡。

本实验提示，脓毒症大鼠模型中给予外源性EPO可阻抑心肌细胞线粒体膜电位降低，抑制心肌细胞凋亡；同时抑制NF-κB活化，减少促炎因子生成，减轻心脏组织的炎症损伤。以上两种机制发挥保护受损心肌，改善心功能的作用。

参考文献

[1]Blanco J， Muriel-Bombin A， Sagredo V， et al.Incidence， organ dysfunction and mortality in severe sepsis： a Spanish multicentre study[J]. Crit Care， 2008， 12（6）：R158.

[2] Manolis AS， Tzeis S， Triantafyllou K， et al.Erythropoietin in heart failure and other cardiovascular diseases： hematopoietic and pleiotropic effects[J]. Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord， 2005， 5（5）：355-375.

[3] Aoshiba K， Onizawa S， Tsuji T， et al.Therapeutic effects of erythropoietin in murine models of endotoxin shock[J]. Crit Care Med， 2009， 37（3）：889-898.

[4] Rittirsch D， Huber-Lang MS， Flierl MA， et al.Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture[J]. Nat Protoc， 2009， 4（1）：31-36.

[5] Angus DC， Linde-Zwirble WT， Lidicker J， et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States： analysis of incidence， outcome， and associated costs of care[J]. Crit Care Med， 2001， 29（7）：1303-1310.

[6] ver Elst KM， Spapen HD， Nguyen DN， et al. Cardiac troponins I and T are biological markers of left ventricular dysfunction in septic shock[J]. Clin Chem，2000， 46（5）：650-657.

[7] 李振华， 董磊， 王国兴， 等. 脑利钠肽、肌钙蛋白T和I监测对重症脓毒症和脓毒症休克预后的意义[J]. 中华急诊医学杂志， 2012， 21（9）：1016-1021.

[8] Silva E， Passos Rda H， Ferri MB， et al. Sepsis： from bench to bedside[J]. Clinics （Sao Paulo），2008， 63（1）：109-120.

[9]宋振举， 郦珊珊， 童朝阳， 等. 脓毒症患者血清促炎和抗炎细胞因子的变化[J]. 中华急诊医学杂志， 2008， 17（11）：1191-1194.

[10]Cinel I， Dellinger RP. Advances in pathogenesis and management of sepsis[J] Curr Opin Infect Dis， 2007， 20（4）：345-352.

[11] Wesche-Soldato DE， Swan RZ， Chung CS， et al. The apoptotic pathway as a therapeutic target in sepsis[J]. Curr Drug Targets， 2007， 8（4）：493-500.

[12] Ge XH， Zhu GJ， Geng DQ， et al. Erythropoietin attenuates 6-hydroxydopamine-induced apoptosis via glycogen synthase kinase 3b-mediated mitochondrial translocation of Bax in PC12 cells[J]. Neurol Sci， 2012， 33（6）：1249-1256.

[13] Caetano AM， Vianna Filho PT， Castiglia YM， et al.Erythropoietin attenuates apoptosis after ischemia-reperfusion-induced renal injury in transiently hyperglycemic Wister rats[J]. Transplant Proc， 2011， 43（10）：3618-3621.

[14] Green DR， Reed JC.Mitochondria and apoptosis[J]. Science，1998， 281（5381）：1309-1312.

[15] Nechushtan A， Smith CL， Lamensdorf I， et al. Bax and bak coalesce into novel mitochondria-associated clusters during apoptosis[J]. J Cell Biol，2001， 153（6）：1265-1276.