肽核酸探针在微生物诊断领域中的应用

摘要：肽核酸（PNA）是近年发展起来的一种脱氧核糖核酸类似物，其可通过与DNA以及RNA进行特异性结合，制成探针，被称为PNA探针。相较于DNA探针，其特异性以及稳定性均有所增加，可以大幅度提高微生物学检测的灵敏度，也可以提高诊断效率，对PNA探针进行继续研究十分具有临床价值。

关键词：肽核酸；探针；微生物；诊断

肽核酸是1991年由丹麦科学家Nielsen等设计的以中性酰胺键为骨架的DNA类似物，其骨架结构单元为（2-氨乙基）甘氨酸，碱基部分通过亚甲基碳基与主骨架氨基连接，可以与DNA特异性结合[1]。其骨架为电中性，与DNA-DNA或RNA-DNA相比不存在静电排斥作用，因此具有很高的核酸亲和性及热稳定性。目前根据不同微生物的特点和诊断方法的要求进行微生物快速诊断主要有三种策略：①分离培养后快速鉴定；②短时间富集后检测；③直接检测。针对rRNA的PNA探针已经成功运用于以上三种方式，而且能够提供了更快速准确的结果，并在此基础上发展出多种检测模式，如基于玻片的荧光原位杂交，基于滤膜的荧光原位杂交、化学发光原位杂交、液相杂交、Q-PNA PCR等。随着以rRNA多态性为基础的微生物分类学的发展，两者结合正在共同推进微生物诊断技术的快速发展。

1 PNA技术

1.1 PNA探针 PNA特殊的结构和性质使其作为探针在微生物诊断领域显示出独特的优势。PNA探针一般是指序列长度为13～18bp的寡聚PNA，其长度比DNA探针短。电中性的骨架使PNA具有比DNA更高的杂交亲和性和碱基配对特异性，并可以通过单碱基错配来分辨不同的核酸序列。PNA探针杂交条件也比DNA探针温和，低离子浓度下也可以发生杂交，且能够抵抗核酸酶和蛋白酶的降解。

1.2自身报告的PNA探针 LightUp探针和LightSpeed探针是荧光标记的PNA探针，LightUp探针是偶联有唾哇橙染料的PNA探针，LightSpeed探针是双标记的PNA探针，即在PNA分子的两端分别联上荧光染料和淬灭剂。在水溶液环境中，LightSpeed探针的构象使荧光染料和淬灭染料彼此靠的很进，荧光被淬灭。当探针与靶序列结合时，荧光剂和淬灭剂在空间上得到分开，使PNA的荧光染料发出荧光。LightUp探针在非杂交状态下是内在非荧光的，当探针与靶序列结合时发出荧光，但这种发光效应与PNA的序列有很大程度的相关性，目前这种关系机制还没有完全清楚。这两种探针都可以用于实时PCR分析，并且具有很高的敏感性和特异性。

1.3 PNA阻断探针 PNA探针与DNA探针相比，特异性虽然明显增强，但其特异性还不能足够精确区分与靶标分子亲缘关系非常接近的序列分子[2]。在这种情况下，我们可以通过非标记的阻断探针来屏蔽非靶标序列，减少标记探针的错误结合，从而提高其特异性。PNA阻断探针有时和化学封闭物同时使用，以消除标记探针与膜的非特异结合，提高特异性。总之，PNA阻断探针仅与标记探针有微弱的结合靶标的竞争效应。我们可以调整阻断探针的浓度，不断优化杂交方案，从而使特异性达到最佳。

2 肽核酸探针技术在微生物检测领域的应用

2.1肽核酸探针技术应用于乙型肝炎病毒检测 有研究人员[3]根据从Genebank上下载的HBV基因组序列，用Alignment软件进行对比分析，选取HBV的保守序列，根据设计引物的一般原则，设计了扩增产物，从Pro.mega公司购买dNTP，自主生产Taq酶，乙型肝炎病毒PCR诊断试剂盒购自安普利生物工程有限公司。分别进行单碱基突变检测和HBV DNA的检测，检测结果显示无论用DNA作为探针还是用PNA作为探针检测单碱基突变，都可根据杂交信号的比值得到正确的杂交结果。而PNA作为探针时对盐浓度的要求更低，杂交信号更强，阴性、阳性探信号强度的对比也更强烈；DNA做探针时为得到相对较好的结果，对洗脱条件的要求更苛刻。而检测HBV DNA的结果显示，用PNA探针检测乙肝患者（大三阳）血清16份，所得结果与使用乙型肝炎病毒PCR诊断试剂盒所得结果完全相同，其中有1例使用试剂盒确定为极弱的阳性，但通过本方法检测为明显阳性。肽核酸探针对核酸链间错配的强识别能力使得该技术在乙型肝炎病毒的检测中发挥重大作用。

2.2肽核酸探针技术应用于鼠疫耶尔森氏菌的检测 鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis，以下简称鼠疫菌）引起的，它是传统生物战剂之一，是用于制造生物恐怖的首选微生物之一，因此对该菌的快速检测与鉴定具有重要意义。F1抗原是鼠疫菌中发现最早的抗原，也是该菌最重要的保护性抗原，因其具有非常高的特异性，c矾基因是Fl抗原的结构基因，编码Fl抗原的亚单位，读码结构为510个核苷酸。

有实验[4，5]以鼠疫菌DNA作为阳性对照进行特异性试验，检测了7种非鼠疫菌株，包括金黄色葡萄球菌、假结核耶尔森氏菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、枯草芽胞杆菌、类白喉棒状杆菌、布鲁氏菌，结果显示只有阳性对照鼠疫菌和伤寒沙门氏菌的信号高于空白对照，其他菌种对应的信号均低于空白对照。出现此结果可能的原因是探针与磁珠或c筘颗粒结合的效率不可能达到100%，使部分颗粒表面缺少探针的覆盖而产生非特异的结合，所以这种检测方法的灵敏度和特异性较荧光定量PCR和常规PCR方法有一定的差距，但作为一种新技术，经过改进，且在研制专用单分子检测仪器的基础上，本方法有望成为不需要PCR扩增、检测灵敏度可与PCR媲美

2.3其他肽核酸探针技术在微生物检测中应用 目前，美国缅因州立大学的研究人员[6]采用有毒赤潮生物Alexandrium藻作为目标藻。采用半自动的三明治杂交方式，研究比较了双标记的PNA探针和相应的双标记DNA探针及三标记DNA探针的检测效果，结果表明，PNA探针的检测效果明显高于DNA探针。此外，针对病原微生物的分子化石一rRNA的序列，设计PNA探针并使之与荧光原位杂交（FISH）技术相结合可有效用来分离、鉴定病原微生物。目前已经有利用该技术从血培养的标本中分离、鉴定出了金黄色葡萄球菌旧引的实验。

参考文献：

[1]李可，张晓峰，王忠才，等.肽核酸探针在微生物诊断领域的应用进展[J].微生物学通报，2012，39（7）：1000-1006.

[2]叶乃芳，王中新.16SrRNA及相关技术用于临床细菌鉴定的研究进展[J].国际检验医学杂志，2015，4：520-522.

[3]于晓云.细菌性角膜溃疡的医院流行病学、诱因和微生物诊断分析[J].中国医药指南，2013，25：147-148.

[4]孙美娟，刘军贤，王雪，等.拉曼光谱技术在微生物学中的应用[J].生物技术通报，2012，10：63-68.

[5]郭辉，王翠娥，彭刚，等.VITEK2 Compact全自动微生物分析系统在啮齿类细菌学检测中的应用[J].实验动物科学，2014，31（2）：16-19.

[6]张丽，徐英春.MALDI-TOF MS在临床微生物实验室的应用研究进展[J].中国感染与化疗杂志，2013，13（3）：226-231.编辑/安桦