固相萃取-液相串联质谱测定人血浆中安妥沙星的药物浓度

摘 要 [HS]建立了专属性更高的固相萃取（SPE）高效液相三重四级杆质谱（LCMS/MS）测定人血浆中安妥沙星的方法。血浆样品经弱阴离子固相萃取柱净化后，洗脱吹干，复溶后进行检测。采用Agilent Eclipse plus C8 色谱柱，流动相为10 mmol/L乙酸铵（pH 3.5）甲醇（35∶65, V/V）, 流速为0.35 mL/min，选择离子检测，线性范围为7.0～5080

SymbolmA@ g/L， R＞0.996，检出限0.5

SymbolmA@ g/L，绝对回收率＞77.6%，日间相对标准偏差＜7.9%。将本方法用于受试者给药后的血药浓度测定，结果满意。

[KH*3/4D][H]关键词 [HS]高效液相色谱三重四级杆质谱； 固相萃取； 安妥沙星

[HT][HK]

[FQ（3２,X,DY－Ｗ][CD15] 20110520收稿；20120316接受

本文系科技部脑血管疾病和耐药性病原菌感染的国际化新药临床评价研究技术平台（No.省略[HT]

1 引 言

安妥沙星（Antofloxacin）为我国自主创新的I类喹诺酮类抗菌药物，其口服剂型近期批准上市，结构见图1插图。临床试验结果显示，该药对革兰氏阴性杆菌、革兰氏阳性球菌有较好的抗菌活性，其疗效略优于左氧氟沙星、氧氟沙星及环丙沙星等，临床上主要用于呼吸道感染、泌尿系感染和皮肤软组织感染\[1\]，其注射剂型目前还在临床开发中。

在临床前动物药代动力学试验\[2,3\]和早期的人体药代动力学试验中\[4\]，测定生物样品中（血浆、尿液、胆汁）安妥沙星药物浓度的方法均为高效液相色谱法（HPLC）。该方法具有样品处理简单，重复性、准确性较好的特点。在临床前的动物试验中发现，安妥沙星体内代谢广泛，消除较快，大鼠体内半衰期为2 h\[2\]，主要代谢物为去甲基代谢物和葡萄糖醛酸结合的II相代谢物\[5\]。人体内安妥沙星的消除较慢，半衰期为20 h\[4\]，表现出明显的种属差异。人体内形成的代谢物较少，但代谢产物种类与动物体内基本一致。安妥沙星和其去甲基代谢物的极性差别很小，在HPLC分析中，其保留时间接近，难以将两者完全区分；另外，按照法规的要求，在药代动力学试验中，需要测到给药后3～5个药物半衰期时的药物浓度，即至少达到给药后的60 h。为此，本研究采用了专属性更强、灵敏度更高的LCMS/MS方法，并将本实验结果与HPLC方法进行比较。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

20A型高效液相色谱系统，由DGU20A3脱气机、LC20AT二元泵、Sil20A进样器、CTO20AC柱温箱组成（日本岛津公司）； AB 3000串联质谱仪（美国Applied Biosystems公司）；Eclipse Plus C8 分析柱（100 mm×4.6 mm×3.5

SymbolmA@ m，美国Agilent公司）；Gemini C18 保护预柱（4.0 mm×2.0 mm，美国Phenomenex公司）；12孔固相萃取仪（美国Supelco公司），Strata XAW 33

SymbolmA@ m, Weak anion mixedmode polymeric sorbent 60 mg/3 mL固相萃取柱（美国Phenomenex公司）；多头氮吹仪（美国Caliper公司）、DL4000B大容量高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；雷磁PHS3C pH计（上海精科公司）；MiliiQ纯水仪（美国Millipore公司）。盐酸安妥沙星（中国药品生物制品检定所，批号103457200201w，以安妥沙星计纯度89.8%）。昌欣沙星（Chinfloxacin, 内标）由浙江医药股份有限公司新昌制药厂提供。三羟甲基氨基甲烷（Tris,分析纯,成都化学试剂厂）。

2.2 样品处理

对于血浆样品，融化后，4000 r/min离心10 min，取0.1 mL于含有0.4 mL水的试管中，加入0.8 mL 10 mmol/L Tris （pH＝6.0），加入内标（甲醇溶液，浓度1509

SymbolmA@ g/L）0.1 mL，加入空白甲醇0.1 mL，混匀，然后用固相萃取小柱进行纯化。萃取前，固相萃取小柱用3 mL甲醇活化、3 mL pH 6.0 10 mmol/L Tris平衡。血浆样品过柱后，用10 mmol/L Tris洗2次，每次0.4 mL，以除去部分杂质。减压抽干5 min。然后用5%氨水甲醇洗脱3次，每次0.5 mL。洗脱液用N2在55 ℃水浴中吹干，残渣用0.1 mL流动相溶解，离心后，置进样小瓶中，备用。

2.3 色谱和质谱条件

Agilent Eclipse plus C8（100 mm×4.6 mm×3.5

SymbolmA@ m）分析柱, 流动相为乙酸铵甲醇（35∶65, V/V），流速0.35 mL/min，柱温35

SymbolpB@ C，进样体积10

SymbolmA@ L。 大气压喷雾离子源（ESI），正离子模式，电压5.5 kV，温度400

SymbolpB@ C，雾化气：13 unit，气帘气：7 unit，碰撞气4 unit。多反应检测模式（MRM），定量离子对m/z 377.1333.4（安妥沙星），内标m/z 438.4354.8（昌欣沙星），碰撞电压 30 V。色谱工作站软件为 Analyst 1.4.2。

分 析 化 学第40卷

第5期魏敏吉等：固相萃取液相串联质谱测定人血浆中安妥沙星的药物浓度

3 结果与讨论

3.1 质谱定量条件的选择

安妥沙星与其内标昌欣沙星均为氟喹诺酮类药物，结构中含有易于和H＋结合的带有孤对电子的N和O原子，在ESI（＋）中易于离子化。对安妥沙星和其内标的标准溶液（2 mg/L）进行一级质谱全扫描，确定其分子离子峰；通过N2对分子离子峰碰撞后产生的碎片进行二级质谱扫描，选择丰度较高的碎片离子作为定性和定量特征离子，结果见表1。[KH*4D][H”][HJ*4]表1 安妥沙星和昌欣沙星的质谱分析参数和保留时间

Table 1 Retention time and optimized MS parameters for analyte and IS

[HT6][BG（][BHDFG3２,WK12,WK9。5W]化合物Compound母离子Parent ion

（m/z）子离子Daughter ion（m/z）碰撞能量Collision energy

（eV）驻留时间Dwell time

（ms）保留时间Retention time

（min）安妥沙星 Antofloxacin377.1

333.4302503.29昌欣沙星 Chinfloxacin438.4354.8302503.4

[BHDFG1*2,WKZQ0W] [BG）W][HT][HJ]

3.2 固相萃取条件的优化

图1 盐酸安妥沙星（A）和盐酸昌欣沙星（内标）（B）空白血浆和受试者给药后的色谱图

Fig．1 Chromatograms of antofloxacin hydrochloride （A） and chinfloxacin hydrochloride （internal standard） （B） in blank plasma and plasma after administration

1. 空白血浆（Blank plasma）； 2. 给药后血浆（Plasma after administration）; antofloxacin 210

SymbolmA@ g/L。

[HT][）]

考察了几种生物样品处理方法。有机溶剂沉淀血浆中蛋白的方法，其离心后的上清液进样或吹干后复溶进样，均因基质效应较高而无法使用；由于安妥沙星为极性和水溶性均比较大的药物，在目前通用有机相水相之间的分配系数较小，采用液液萃取的方法的回收率太低。因此，本实验采用了固相萃取的方法。实验中选择了强阴离子、弱阴离子混合型、C18固相萃取柱进行回收率测试。结果表明，安妥沙星和内标在强阴离子固相萃取中吸附强，使用5%氨水甲醇不易将其洗脱，导致回收率不高；而C18固相萃取柱对安妥沙星和内标的吸附很弱，回收率也很低；混合型固相萃取柱，对内标和安妥沙星有很好的保留，且使用5%氨水甲醇容易洗脱，回收率大于77%，数据稳定、重复性好。

3.3 色谱和质谱条件的选择

应用Eclipse Plus C8柱，以10 mmol/L乙酸铵（pH 3.5）甲醇（35∶65, V/V）为流动相，流速为0.35 mL/min时，进样分析时间为5 min，安妥沙星保留时间为3.29 min，内标昌欣沙星保留时间为3.40 min。空白基质不影响安妥沙星和内标的定量分析（图1）。

3.4 线性范围和检出限采用安妥沙星的储备液（193.91 mg/L, 甲醇溶解），用甲醇进一步稀释成为5080～7.0

SymbolmA@ g/L的标准曲线工作液。使用空白血浆，用0.1 mL工作液代替空白甲醇，按照样品处理方法进行处理和测定，根据安妥沙星分析物的峰面积和其内标峰面积的比值与安妥沙星相应的浓度进行加权回归（权重为1/Y2），绘制标准曲线。浓度在7.0～5080

SymbolmA@ g/L的范围内，线性关系为y＝0.00386x

Symbolm@@ 0.00878，相关系数r＝0.9994。

本方法的最低检测浓度可以达到0.5

SymbolmA@ g/L（S/N＞5），考虑到给药后体内安妥沙星的药物浓度较高，测定非常低的浓度没有临床意义。因此，本方法的最低定量浓度定为6.97

SymbolmA@ g/L。

3.5 方法回收率、基质效应和精密度

做高中低3个浓度水平的空白血浆加标准品与相应的药物溶液峰面积比的方法验证回收率。精密度采用3个 浓度的质控样品每日测定6份，连续3 d的方法。结果见表2。其中内标的回收率为81.3%。

3.6 受试者给药后血浆中安妥沙星的药物浓度测定

采集临床上11名受试者口服400 mg安妥沙星后不同时间的血浆，利用本方法测定其中安妥沙星的药物浓度。结果见图 2。

3.7 两种测试方法的结果比较

将采集的200 mg剂量组的某一个受试者的血浆同时用HPLC方法和本方法进行测定,见图3。从图3可见，两种方法的测定结果基本一致。在HPLC方法中，代谢产物的影响可以忽略不计，但HPLC只能测定到给药后的48 h；LCMS/MS方法可以在给药后整个血样采集区间内顺利测定其药物浓度。

[（４*2][H”] 图2 11 名受试者口服给予400 mg安妥沙星后平均血浆药物浓度时间曲线

Fig．2 Average plasma concentration vs time curve after 11 subjects were orally given 400 mg of antofloxacin[HT][）]

[（４*2][H”] 图3 HPLC方法和LCMS/MS方法测定结果比较

Fig．3 Analytical results comparison between HPLC and LCMS/MS

[HT][）]

本研究结果表明：利用固相萃取串联质谱的方法测定人血浆中安妥沙星的浓度，与HPLC法相比具有更高的灵敏度、专属性更高、分析时间短、测定速度快；本实验所用的内标为另一个结构全新的抗菌药物，由于可以与本实验测定的药物互为内标，本方法可为测定血浆中昌欣沙星的含量提供一定的参考价值。

References

1 Wang J, Xiao Y, Huang W, Xu N, Bai C, Xiu Q, Mei C, Zheng Q. Chemother, 2010, 56（5）: 378～385

2 HU JieHui, XIE Lin, LIU XiaoDong. J. China Pharm. Univ.， 2006, 37（2）: 153～156胡婕慧, 谢 林, 刘晓东. 中国药科大学学报， 2006, 37（2）: 153～156

3 Xiao X M, Xiao Y H. Acta Pharmacol. Sin., 2008, 29（10）: 1253～1260

4 Xiao Y, Lu Y, Kang Z, Zhang M, Liu Y, Zhang M, Li T. Biopharm. Drug Dispos., 2008; 29: 167～172

5 Liang Y, Liu L, Lu S, Xie L, Kang A, Xie T, Xie Y, Sheng L, Liu X, Wang G J. J. Pharm. Biomed. Anal., 2009， 50（5）: 1022～1025

Determination of Antofloxacin in Human Plasma by Solid

Phase ExtractionLiquid ChromatographyMass Spectrometry

WEI MinJi*, ZHAO CaiYun, MAO LongQing, KANG ZiSheng, LI TianYun, L Yuan

（Institute of Clinical Pharmacology, First Hospital, Peking University, Beijing 100191, China）

Abstract A new and specific method has been developed for the determination of antofloxacin in human plasma by solid phase extractionliquid chromatography coupled with tandem spectrometry. The samples were extracted and purified by wean anion solid phase extraction. The eluent was dried and reconstituted before analysis. The separation was performed on an Agilent Eclipse plus C8 column, with a mobile phase consisting of 10 mmol/L ammonium acetate（pH 3.5）methanol（35∶65, Ｖ/Ｖ） at a flow of 0.35 mL/min. Identification and quantification were achieved by LCMS/MS in a positive mode and multiple reactions monitoring （MRM）. Good linearity was observed in a range of 7.0－508０

SymbolmA@ g/L with a correlation coefficient of more than 0.996. The detection limit was 0.5

SymbolmA@ g/L. Sample recovery was ＞77.6%, and interday coefficient of variation was less than 7.9%. The proposed method has been applied to the determination of antofloxacin in plasma after subjects were orally given 400 mg of antofloxacin tablets.

Keywords High performance liquid chromatographytandem mass spectrometry; Solid phase extraction; Antofloxacin

（Received 20 May 2011; accepted 16 March 2012）

《生物质材料现代分析技术》（ISBN 9787122093165）

该书系统地介绍了现代分析技术在生物质材料结构分析中的应用，主要内容包括傅里叶变换红外光谱、核磁共振谱、X射线光电子能谱、凝胶渗透色谱、电子自旋共振谱、气相色谱傅里叶红外光谱联用、X射线衍射、激光小角散射、扫描电子显微技术、原子力显微技术、动态力学分析、热重分析、差示扫描量热分析、锥形量热分析以及流变分析等现代分析技术。本书内容丰富，简明易懂，注重应用实例的分析。该书适合材料科学与工程等专业技术人员和科技工作者阅读参考，同时可作为相关学科专业的本科生和研究生的教材或参考书使用。该书由化学工业出版社出版，邸明伟、高振华 主编，定价 48.0元。

第40卷2012年5月 分析化学 （FENXI HUAXUE） 研究简报Chinese Journal of Analytical Chemistry 第5期791～795

[BW（B（S*3/4,0,）][CD44][BW）]

DOI： 10.3724/SP.J.1096.2012.10722