柱前衍生-反相高效液相色谱法测定2-去氧葡萄糖的含量

摘 要 [HS]采用对氨基苯甲酸乙酯为衍生化试剂，建立柱前衍生化反相高效液相色谱法（RPHPLC）测定2去氧葡萄糖的含量。结果表明，最适的衍生化条件为反应温度85 ℃，反应时间1.5 h，衍生化试剂（ABEE）和单糖（2DG/Glu）的摩尔比为25∶1；色谱条件为色谱柱Hypersil ODS2 （250 mm × 4.6 mm，5

SymbolmA@ m），流动相为0.02%TFA乙腈（80∶20，V/V） ，流速1.0 mL/min，波长307 nm。本方法在1～700 mg/L 浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系（r＝0.9999）；定量限（S/N＝10）及检出限（S/N＝3）分别为450和100

SymbolmA@ g/L；平均加标回收率为101.7%；RSD为0.7%；日内及日间精密度均小于0.7%。表明本方法灵敏度高，测定结果准确，重复性好，可用于2去氧葡萄糖样品的准确定量分析。

[KH*3/4D][H]关键词 [HS]2去氧葡萄糖； 柱前衍生； 反相高效液相色谱法； 对氨基苯甲酸乙酯

[HT][HK]

[FQ（3２,X,DY－Ｗ][CD15] 20110701收稿；20111123接受

本文系海洋公益性行业科研专项经费基金 （No.201005020），福建省科技重大专项经费基金 （No.省略 [HT]

1 引 言

2去氧葡萄糖（2Deoxyglucose，2DG）是多种天然抗生素及抗肿瘤药物的药效成分，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗衰老、止血及镇痛等\[1,2\]多种生理药理效应，在医药、食品、化妆品及科学研究领域\[3,4\]具有广阔的应用前景。建立2DG的快速定量方法，对糖生物学与糖医学等科学研究及应用具有重要意义。

2DG的检测方法有离子色谱法和柱前衍生高效液相色谱法\[5,6\]。前者方便、准确，但通用性不佳；后者不仅测定结果准确，还可以克服其缺点。文献\[6\]曾采用对氨基苯甲酸乙酯（pAminobenzoic ethyl ester，ABEE）衍生化法分离分析2去氧葡萄糖，但所采用的色谱柱是耐碱性的C18柱，流动相为pH 9.0的硼酸钾缓冲液，这对常用的C18柱（pH＝2.0～8.0）几乎不适用。本研究采用0.02%三氟乙酸（pH 2.65）乙腈为流动相，适用于几乎所有C18柱，并以等度洗脱代替梯度洗脱，缩短分析时间；文献\[7～9\]报道过的ABEE衍生化法所用的糖浓度都较高（25.6 mmol/L），未见采用低浓度糖溶液衍生化的方法。本研究建立的低浓度（2 mmol/L）糖溶液衍生化的方法，为低浓度糖溶液的衍生化提供了参考。本研究采用柱前衍生反相高效液相色谱法同时分离分析2去氧葡萄糖和葡萄糖，方法具有通用性广、分析时间短、灵敏度高、测定结果准确、稳定性好等优点。2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Alliance 2695高效液相色谱仪（配2996二极管阵列检测器）, 3100单级四极杆液质联用仪; MicroMass LCT PremierTM XE高分辨质谱仪（美国Waters公司）；Bruker VERTEX70 红外光谱仪; Bruker400 核磁共振仪（德国Bruker公司）。

2DG（自制）；葡萄糖（中国药品生物制品检定所）；鼠李糖（99%），阿拉伯糖（98%），对氨基苯甲酸乙酯（99%），氰基硼氢化钠（95%）均购自Aladdin公司；三氟乙酸、甲醇、乙腈（色谱纯，Tedia 公司）；冰醋酸（分析纯，西陇化工股份有限公司）；超纯水（电阻率≥18.2 MΩ・cm，自制）。

2.2 色谱及质谱条件

色谱条件：Hypersil ODS2 （250 mm×4.6 mm，5

SymbolmA@ m）；柱温：25 ℃；进样体积：10

SymbolmA@ L；流动相： 0.02%TFA乙腈（20∶80，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：307 nm。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；电离电压（毛细管电压）3.5 kV；一级锥孔电压35 V；二级锥孔电压3.0 V；六级杆透镜电压0.1 V；源温度（Source temperature）120 ℃；脱溶剂温度350 ℃；脱溶剂氮气流速500 L/h；锥孔氮气流速50 L/h；高、低质量数分辨率均为15；质谱扫描范围m/z 100～400。

2.3 样品处理

准确称取2DG样品25 mg，用超纯水溶解定容25 mL， 摇匀后取出1.0 mL定容，依次加入1.0 mL 0.15 mol/L ABEE甲醇溶液、1.0 mL 0.08 mol/L NaBH3CN甲醇溶液和50

SymbolmA@ L冰醋酸，于85 ℃水浴中反应1.5 h，取出放冷至室温，用超纯水定容至25 mL，溶液经0.45

SymbolmA@ m滤膜过滤后直接进样，进样量10

SymbolmA@ L。3 结果与讨论

3.1 2DG的结构确证

自制的2DG经紫外扫描发现, 在195 nm处有很弱的紫外吸收；红外光谱（KBr压片法）：3412，3353，3258 （υOH），2925（υＣH），1461，1411，1366（δＣH），1119，1082，1009（υCO）；核磁共振（400 MHz，DMSO）氢谱：6.51 （1H，d，CHO），4.78 （2H，m，OH），4.61 （1H，m，OH），4.46 （1H，m，OH），3.66～3.42 （2H，m，CH2（OH）），3.33 （1H, m, CH），3.01 （1H，m，CH（OH）），2.91 （1H，m，CH（OH）），1.89～1.25 （2H，m，CH2）；碳谱：13C1（93.38），13C2（76.78），13C3（71.60），13C4（70.79），13C5（61.26），13C6（41.25）；高分辨质谱显示的准分子离子峰m/z 187.0582 \[M＋Na\]＋ 与2DG结构分子量相符。以上数据可以确证2DG的结构。

3.2 衍生化条件的优化

衍生化时间、温度及衍生化试剂与单糖的摩尔比均会影响衍生化反应产率（图1）。本实验确定衍生化反应的最佳条件为反应时间： 1.5 h； 反应温度：85 ℃；ABEE与2DG/Glu的摩尔比为25∶1。衍生化反应式见图2。

图1 反应时间（a）、反应温度（b）和衍生化试剂（ABEE）与2DG/Glu的摩尔比例（c）对衍生化反应产率的影响

Fig．1 Effects of reaction time（a）, reaction temperature（b）and molar ratio of paminobenzoic ethylester （ABEE） to 2deoxyglucose/glucose （2DG/Glu）（c）on derivative reactions

（）2DG； （）Glu．[HT][）]

分 析 化 学第40卷

第5期尤小云等： 柱前衍生反相高效液相色谱法测定2去氧葡萄糖的含量

图2 2DG和ABEE衍生化的反应式

Fig．2 Reaction course of 2DG with paminobenzoic ethyl ester[HT][）]

3.3 LCMS结果

按2.3节处理样品，将2DG和Glu混合，进行柱前衍生化反应，反应产物在2.2节的色谱及质谱条件下进行LCMS分析，得到的色谱与质谱图如图3所示。其中，图3B中a及b分别为图3A峰1及峰2的全扫描质谱图。图3Ba的基峰质荷比为330，与Glu衍生化产物的加氢分子离子峰（\[Glu＋ABEE＋H\]＋）的质荷比一致；图3Bb的基峰质荷比为314，与2DG衍生化产物的加氢分子离子峰（\[2DG＋ABEE＋H\]＋）的质荷比一致。此结果表明：2DG及Glu与衍生化试剂ABEE的反应是按照（图2）所推断的1:1进行的，2DG和Glu的衍生化产物与H＋结合，产生稳定的准分子离子峰m/z 314和330。LCMS总离子流图（图3A）同时显示，衍生化试剂在单糖衍生产物之后出峰，无需萃取除去，不会干扰2DG及Glu的测定，简化了衍生化步骤。

图3 2DG及Glu衍生物的LC/MS色谱图（A）及质谱图Ba和Bb

Fig．3 Chromatograms of LC/MS （A） and mass spectra （Ba and Bb）of 2DG and Glu derivatives

1. Glu（m/z 330）；2. 2DG（m/z 314）； Ba. 峰1的质谱图（Mass spectra of peak 1）； Bb. 峰2的质谱图（Mass spectra of peak 2）。[HT][）]

图4 4种单糖衍生物的色谱图

Fig．4 Chromatograms of four derivatized monosaccharides

1. Glu衍生物（Glucose derivative）； 2. 阿拉伯糖衍生物（Arabinose derivative）； 3. 鼠李糖衍生物（Rhamnose derivative）； 4. 2DG衍生物（2DG derivative）； 5. 对氨基苯甲酸乙酯（pAminobenzoic ethyl ester）。[HT][）]

3.4 方法专属性

考察常见单糖对2DG测定结果的影响。将鼠李糖、葡萄糖及阿拉伯糖与2DG混合，按最适的衍生条件与ABEE衍生后，在2.2节的色谱条件下进行HPLC分析。2DG的回收率为103.1%；RSD为0.9%。4种单糖衍生物的色谱图如图4所示，表明在其它单糖存在的情况下，不会影响2DG的定性及定量分析。

3.5 线性关系、检出限及定量限

按2.3节配制浓度分别为1, 10, 20, 40, 100, 200, 300, 400, 500, 600和700 mg/L的样品溶液，进样量均为10

SymbolmA@ L，峰面积（y）对进样浓度（x）的线性回归方程为y＝54533x＋26685，相关系数r＝0.9999，线性范围为1～700 mg/L。逐级稀释样品溶液，当信噪比（S/N）为3时，确定其检出限为100

SymbolmA@ g/L；信噪比（S/N）为10时，确定其定量限为450

SymbolmA@ g/L。

3.6 日内及日间精密度、重复性和稳定性

按2.3节配制的低、中、高浓度的样品溶液，测定其日内及日间精密度，结果见表1。3种浓度的日内

[ＦＱ（８２。２０，Ｙ－ＷＺ][H”][HJ*4]表1 2DG衍生物的日内及日间精密度

Table 1 Interday and intraday precision of 2DGderivative

[HT6][BG（][BHDFG4,WK１２，ＷＫ１４Ｗ]2DG衍生物的浓度

Concentration of 2DG

derivative（mg/L）RSD（%）日内Interday日间Intraday

320.70.6400.10.4480.10.5[BHDFG1*2,WKZQ0W] [BG）W][HT][HJ]

和日间RSD均小于0.7%，日内和日间精密度良好。

配制3个不同浓度的2DG溶液，按2.3节进行衍生化反应（n＝3），测得平均含量为102.0%，RSD为0.4%，表明方法的重复性良好。样品溶液于25 ℃放置，分别在0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12和24 h进样，考察衍生产物稳定性，9个时间段峰面积的RSD为0.3%，表明样品在24 h内稳定性良好。

3.7 实际样品的检测结果

对2DG样品进行3种不同浓度水平的加标回收实验（n＝3），结果见表2。平均回收率为101.7%；RSD为0.7%，说明本方法的检测结果准确度良好。实际样品的检测结果见表3。

[KH*4D][H”][HJ*4]表2 2DG样品的加标回收率

Table 2 Average recovery of 2DG sample

[HT6][BG（][BHDFG４,WK７\.4W]加入量Added（mg）

测得量Obtained

（mg, n＝3）

回收率

Recovery

（%, n＝3）RSD（%）10.1610.34101.8

12.7013.00102.4 0.74

15.2415.34100.9 [BG）Ｆ][HT][HJ]

[][H”][HJ*4]表3 样品分析及结果

Table 3 Analytical results of samples

[HT6][BG（][BHDFG４,WK8,WK20W]组分

Component

（%）

样品 SamplesS1S2S3S42DG97.3598.6497.1097.9997.23Glu1.291.362.422.012.56[BG）Ｆ][HT][HJ]

结果表明， 本方法可同时测定2去氧葡萄糖和葡萄糖含量，敏度高、线性范围宽以及稳定性好。

References

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Detection of 2Deoxyglucose by Precolumn Derivation Reversed

Phase High Performance Liquid Chromatography

YOU XiaoYun1,2, HONG BiHong*2,4, XIE QuanLing2, YI RuiZao1,2, XU RuiAn1,3

1（Institute of Molecular Medicine, Huaqiao University, Quanzhou 362021, China）

2（The Third Institute of Oceanography State Oceanic Administration, Xiamen 361005, China）

3（Xiamen Key Lab of Marine & Gene Engineering Drugs & Engineering Research Center of Molecular Medicine,

Ministry of Education, Xiamen 361021, China）

4（Department of Materials Science and Technology, College of Chemistry and Chemical Engineering,

Xiamen University, Xiamen 361005, China）

Abstract A method was developed for the determination of 2deoxyglucose（2DG）by reversed phase high performance liquid chromatography （RPHPLC） after precolumn derivated with paminobenzoic ethyl ester （ABEE）. The results showed that the optimum derivation conditions were as follows: reaction temperature was 85 ℃, reaction time was 1.5 h and molar ratio of derivative reagent （ABEE） to monosaccharide （2DG/Glu） was 25∶1. The derivative was analyzed on a Hypersil ODS 2 （250 mm×4.6 mm，5

SymbolmA@ m） column with a mixture of acetonitrile to 0.02% trifluoroacetic acid （TFA） （2∶80, V/V） as the mobile phase, at the flow rate of 1.0 mL/min and the detection wavelength at 307 nm. This method has a good linearity at the concentration from 1 mg/L to 700 mg/L （r＝0.9999）.The limit of detection was 100

SymbolmA@ g/L while the quantitative limit was 450

SymbolmA@ g/L. The average recovery of 2DG was 101.7% and the relative standard deviation （RSD） was 0.7%. The interday and intraday precision were both less than 0.7%，This method is of high sensitivity , precision and repetition, indicating that it is suitable for precise quantitative determination of 2DG.

Keywords 2Deoxyglucose; Precolumn derivatization; Reversed phase high performance liquid chromatography; pAminobenzoic ethyl ester

（Received 1 July 2011; accepted 23 November 2011）

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