LpxC抑制物抗菌活性研究

摘要：UDP-3-O-(R-羟基十四酰)-N-乙酰氨基葡糖脱乙酰酶（LpxC）是一种锌金属酶，催化革兰阴性菌中类脂A生物合成的第2步，为革兰阴性菌的生存所必需，近年作为抗菌药物靶位点的研究较多。本文主要从苯唑啉基羟肟酸类抑制剂和底物类似物羟肟酸类抑制剂两方面对近年研制开发的抑菌剂作综述。

关键词：LpxC；抗菌剂；锌金属酶

中图分类号：Q555文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)01-0042-04

Research Advance in Antibacterial Activity of LpxC Inhibitors

LU Nan-nan，GENG Yue*

(College of Life Science, Shandong Normal University, Jinan 250014, China)

Abstract：UDP-3-O-(R-3-hydroxymyristoyl)-N-acetylglucosamine deacetylase (LpxC) is a zinc metalloenzyme, which catalyzes the second step in the biosynthesis of lipid A. Because it is necessary for Gram-negative bacterial growth, the antibacterial agents targeting LpxC become more and more popular in recent years. This article mainly introduces the latest antibacterial agents from two aspects: phenyloxazoline-based hydroxamates inhibitors and substrate analogs containing hydroxamates inhibitors of the antibacterial agents targeting LpxC.

Key words：LpxC；antibacterial agent；zinc metalloenzyme

外膜作为革兰阴性菌的特有结构，是细胞通透性的屏障。外膜由脂多糖（LPS）和核心蛋白组成。毒性脂多糖是内毒素的成分，多在细菌死亡后自溶释出，也可在代谢过程中释出。人体内的革兰阴性菌不断产生大量内毒素，在许多病理生理过程中会越过肠黏膜屏障入血，形成内毒素血症。目前抗内毒素治疗途径主要有2条：一是通过结合内毒素，中和并阻断其作用，加速其灭活，同时与抗菌药物合用可增强抗革兰阴性菌感染的作用；二是抑制和破坏内毒素刺激靶细胞活化的级联反应，阻断或减少炎性细胞因子的产生。目前国内外尚无一种疗效明显、毒副反应低、价格低廉的抗内毒素感染的理想药物[1-3]。LPS通过类脂A锚定在细胞膜上，因此，类脂A的生物合成在细菌生长过程中起着极其重要的作用。

类脂A是革兰阴性菌外膜上的一种免疫性糖脂，负责LPS在膜上的疏水锚定，在革兰阴性菌的生长中起重要作用。从大肠杆菌（Escherichia coli）和鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）中分离得到的类脂A，都是由1,4′位上磷酸化的β-1′-6连接的氨基葡萄糖二糖的亚单位组成，亚单位上派生出6条脂酰链[4, 5]。E.coli中所有类脂A合成过程中的酶及编码它们的基因均已被鉴别，单拷贝基因编码的类脂A合成酶及它的同源体在几乎所有已测序的革兰阴性菌中都有发现，为寻找新的抗菌试剂提供了靶点[6]。在特定的lpxA，lpxC，lpxD基因突变体中已证明菌株对一些疏水性抗生素，如红霉素的高敏感性降低[7]。类脂A合成过程中的第1步为LpxA基因编码产物参与催化的反应，即将R-3-羟基十四酰链从酰基载体蛋白转移到UDP-N-乙酰氨基葡萄糖氨基葡萄糖环的3位上，这步反应在热力学上是无效的。随后的第2步反应是类脂A合成中关键的一步，由UDP-3-O(R-羟基十四酰)-N-乙酰氨基葡糖脱乙酰酶（LpxC）催化。LpxC与其它的脱乙酰酶不具有序列同源性，所以它能够作为抗菌的选择性靶点而且毒性很小，近年来越来越受到重视。

1LpxC概述

LpxC是一种胞质锌金属酶[8]，催化类脂A生物合成的第2步，也是关键性的一步（图1），即从3-酰基-2-乙酰-氨基葡萄糖上脱去一个N-乙酰基团。从不同的菌种中得到LpxC的序列比较得出10个His，Asp，Glu保守残基可能在催化中起作用。通过测定氨基酸的定点突变对催化活性的影响，3个His和1个Asp是保持催化活性所必需的[9]。Jackman等[9, 10]对LpxC进行结构分析证实：它含有1个单独的催化性的锌离子，与2个组氨酸残基氮结合，再结合1个组氨酸氮或天冬氨酸或谷氨酸形成羧酸酯，同时还结合1个水分子。LpxC由lpxC基因编码，它的整体折叠属于α+β家族。整个结构由16个残基连接的2个结构域组成，每个结构域包含5个β折叠片和2个主要的a螺旋。2个结构域的2级拓扑结构已被鉴别出，活性位点定位于2个结构域的界面，两侧为一些小的亚结构域，如：βββ，βαβ等[11]。McClerren等[12]通过研究类脂A合成过程中LpxC的动力学数据发现，LpxC中Glu73作为去质子化的广义碱，激活锌离子结合水。而Marey等[13]研究发现，LpxC的脱乙酰酶催化活性是通过Glu78和His265的酸碱催化及锌离子结合水的亲和试剂作用实现的。

图1类脂A的结构及生物合成途径

2抑制剂

针对LpxC设计的最早的抑制剂是苯唑啉基羟肟酸（phenyloxazoline-based hydroxamates）类抑制剂。此类抑制剂是根据锌金属酶的共性而设计的，通过羟肟酸与锌离子的相互吸引使抑制剂与催化性的锌离子结合，以取代锌离子所结合的水分子而起到抑制作用。在早期的研究中发现，将羟肟酸基团改变为1个羧基，所有的LpxC抑制活性和抗菌活性全部消失[5]。最早的此类抑制剂是L-573，655和LNTI-229（图2），实验结果表明，在30 ℃，pH 5.5条件下，以UDP-3-O(R-羟基十四酰)-N-乙酰氨基葡萄糖作底物，该类抑制剂对大肠杆菌LpxC有明显的抑制作用。特别是LNTI-229，其对于野生型大肠杆菌的抗菌活性与氨苄青霉素相当，但在同样条件下，该类物质对A.aeolicus LpxC的活性无明显抑制作用。此类抑制剂对普遍人类病原菌铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）几乎也不显示抗菌活性[4]。为了寻找一类广谱的LpxC抑制剂，研究人员进行了多次尝试。Chen等[14]在化学方面，对这类含有苯环、唑啉环羟肟酸功能基团的化合物进行了一些修饰，主要是对苯环或唑啉环进行酯化修饰，或是对一些对映体进行研究，但未取得明显效果。近来Amander等报道了一种可与LpxC进行缓慢紧密结合的抑制剂CHIR-090，它的抗菌活性与环丙沙星相当。CHIR-090与A.aeolicus LpxC的结合分为2步：第1步是非常迅速的可逆反应；第2步需要一个缓慢的不可逆的转变过程[15]，底物的积累不会影响这种缓慢的过程，因而不能解除抑制作用[16]。

图2LNTI-229，L-573，655及CHIR-090的结构

3底物类似物羟肟酸类抑制剂

苯唑啉基化合物L-573，655和LNTI-229对E coli的抑制需要羟肟酸基团的存在，为了寻找广谱的酶活性抑制剂，Jackman等合成了一系列包含羟肟酸功能基团的LpxC底物的类似物。这些潜在的酶抑制剂包含一个四氢吡喃环，对应于LpxC底物的N-乙酰基团被羟肟酸取代。在相同条件下，TU-514和TU-517的抑制效果最好[4]（图3）。TU-514在体外高效抑制多种LpxC，包括E.coli和A.aeolicus LpxC，却有很少或没有抗菌活性，因为他们不能透过阴性菌的外膜[14]。TU-514与AaLpxC形成的复合物结构揭示出一种新型的ab折叠和一种独特的锌离子结合模型。复合物形成过程中AaLpxC的疏水通道捕获了TU-514的酰基链[9, 17]。Gennadios等[18]对LpxC与TU-514形成的复合物进行X射线晶体结构研究，发现TU-514的羟肟酸基团与Zn2+形成螯合体，同时与保守活性位点的Glu78，His265，Thr191氨基酸残基以氢键结合。抑制物TU-514 C-4位的羟基与Glu197，His58形成氢键，而C-3位的豆蔻酸盐则与活性位点的疏水通道相结合。这些分子间相互作用的阐明为了解酶-底物（抑制剂）间的结合提供了指导。在E.coli中LpxC底物葡萄糖环3-OH位置连接不同的酰基链，已制备出不同的底物类似物抑制剂，并且实验结果显示，对E.coli和A.aeolicus LpxC的抑制性依赖于酰基链的长度，随酰链的变短抑制活性降低甚至丧失。其他的一些底物类似物是用酮、羧酸酮或是三氟甲基酮类基团取代羟肟酸部分，但均不显示抑制活性。以前的研究发现像嗜热菌蛋白酶、羧肽酶A、胶原酶等许多锌离子金属酶可被含有磷酸酯（盐）基团的化合物所抑制[19]，因此设计了此类化合物6SHT55进行实验，发现含有亚磷酸酯的与底物类似物6SHT55相似的IC50，对E.coli和A.aeolicus LpxC都有抑制作用，而且6SHT55的抑制活性不具有时间依赖性。尽管在E.coli中含亚磷酸酯的6SHT55对LpxC的抑制效果不如含羟肟酸的抑制物，但对于A.aeolicus LpxC来说，6SHT55是一种较好的抑制剂，这说明亚磷酸酯取代物在某些时候可以扩大抑制范围[4]。

图3TU-517，TU-514及6SHT55的结构

4结语

苯唑啉基羟肟酸类抑制剂在体外和动物模型中均显示抑菌作用，但作用范围较小，不能作为广谱的抗菌试剂使用。LpxC底物类似物的抑制剂，在体外对E.coli LpxC的抑制接近于LNTI-229，但对野生型E.coli的抑制活性却不十分明显。表明此类化合物可能不能进入细胞，或是在细胞中被代谢后排出。但这类抑制剂体外几乎对所有革兰阴性菌的LpxC有抑制作用，支持LpxC保留有共同的结构特征的说法。一种广谱的抑制剂应作用于LpxC的保守结构区和酶活性位点表面。抑制剂对LpxC的识别主要是与锌离子作用，目前已研究出多种此类的抑制剂。其次是识别活性位点的保守表面，主要是疏水通道。设计专一作用于疏水通道的潜在的抑制剂是今后研究的一个方向。Kline等[20]对P.aeruginosa LpxC抑制物的研究和Mdluli等对P. aeruginosa LpxC的分子确认研究的数据提示，P. aeruginosa LpxC可作为新型抗菌药物的靶点，为临床重要的革兰阴性菌抗菌试剂的设计提供指导[21]。随着LpxC酶的动力学和酶-抑制剂结合拓扑学研究的深入，有望设计出疗效明显、毒副反应低、价格低廉的抗内毒素感染的理想药物。

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