雄黄遗传毒性的研究

【摘要】 目的 评价雄黄的急性毒性和遗传毒性，为临床提供毒理学依据。方法 急性毒性：设3.50、2.98、2.53、2.15、1.83、1.55g/kg剂量组灌胃，对照组给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液(Sodium Carboxymethyl Cellulose，CMC)。Ames试验：设雄黄浸出液原液、1：1、3：1、7：1和15：1稀释作为中、低、次低和最低剂量组，各剂量组均加不同浓度的雄黄浸出液0.5ml，观察加或不加S9混合物对TA 97、TA 98、TA 100、TA 102、TA1535菌株的影响。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验：设1、0.5、0.25g/kg三个剂量组，2次灌胃后，24h制片，镜检。CHL细胞染色体畸形试验：设雄黄浸出液1：15、1：31、1：63稀释液三个剂量，加药后将细胞放入CO2培养箱中37℃培养24-48小时。终止培养前4小时，每只细胞培养皿中加入秋水仙素溶液0.1ml，收获细胞，制染色体标本、镜检。结果 急性毒性试验表明：本次实验雄黄的LD50为2.069g/kg。Ames试验：为阴性结果，雄黄有抑制细菌生长的作用。雄黄对小鼠骨髓嗜多染红细胞有致突变作用和对CHL细胞染色体有致畸变作用。结论 本次试验中该批次的雄黄有一定的遗传毒性。

【关键词】 雄黄；遗传毒性；急性毒性

雄黄（realgar）是矿物类中药，主要成分为三硫化二砷（As2S3）。现代药理学证明雄黄具有抗肿瘤、镇痉、止痛、杀虫和抗菌等功效［1］。长期以来中医认为雄黄有毒，内服宜慎，不可久用，孕妇禁用，因此雄黄一直作为有毒中药受到药监部门的严格控制。雄黄含有对人体有害元素砷，临床上亦有过量服用而中毒的报道［2］。对雄黄的毒理学研究发现，雄黄具有肝肾毒性［3-4］，但是否具有遗传毒性报道不多，为此我们用小鼠骨髓细胞微核试验(micronucleus tes，MT)、CHL细胞染色体畸变试验(in vitro mammalian cells chromosome aberration test)和鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（the rat typhoid salmonella mutate back test，AMES）对雄黄进行遗传毒性研究。1 材 料

1.1 实验动物 ICR小鼠35-38g；由上海斯莱科动物有限公司提供［实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2007-0005。动物购入后，均饲养在清洁级动物实验室内，温度控制在20-25℃，湿度控制在40-70%。动物自由摄食、饮水，1周换1-2次垫料。Ames标准实验菌株，实验前对各个菌株性状进行鉴定。由上海市疾控中心赠与。CHL细胞株，由上海中科院药物所赠与。

1.2 主要仪器及试剂

1.2.1 Motic BA400生物显微镜。

1.2.2 主要试剂 雄黄，产地湖南，由上海封浜中药饮片厂加工炮制成饮片为橙黄色细粉末，批号为H2007052401。羧甲基纤维素钠（CMC-Na）批号F20090508；环磷酰胺，批号9J596A；Giemsa染液及其他试剂均为国产分析纯。2 方 法

2.1 实验方法

2.1.1 小鼠急性毒性试验 ICR小鼠70只，体重20-24g，雌雄各半，采用随机分组法将小鼠分为7个组，雄黄各剂量组间距比设为1：0.85依次递减。空腹灌胃1次，观察2周。

2.1.2 小鼠骨髓微核试验［5］ ICR小鼠30只，体重35-38g，将小鼠分为5组，雄黄给药组剂量分别为0.25、0.5、1g/kg，阳性对照组为环磷酰胺80mg/kg，（给药一次）阴性对照组为等量羧甲基纤维素钠溶液（0.5%CMC），分2次灌胃，给药后24h处死小鼠，取一侧股骨骨髓材料制片、染色、镜检阅片，每片检测2000个嗜多染红细胞，计数微核数，求出各组微核率(MNF)，并进行显著性检验。

2.1.3 CHL染色体畸变试验［6］ 将1g生药溶解于10ml的HBSS中形成混悬液，37℃水浴摇床以100转/分水浴震荡4小时后静止20小时，取上清液过滤后制成雄黄浸出液备用。将不同稀释度的雄黄浸出液（1：15、1：31、1：63稀释）加入到单层CHL细胞上，将细胞放入CO2培养箱中37℃培养24-48小时。终止培养前4小时，每只细胞培养皿中加入秋水仙素溶液0.1ml，使其终浓度达到0.2μg∕ml。然后收获细胞，制染色体标本。在光学显微镜下观察染色体中期分裂相，分别记录染色体的结构畸变，数目畸变（多倍体）以及畸变细胞数和畸变类型，分析判断在体外雄黄对CHL细胞的染色体畸变作用。本试验同时设立阴性对照（DMSO）和阳性对照（非活化阳性对照丝裂霉素C）。

2.1.4 Ames［7］ 试验鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型突变菌株TA 97、TA 98、TA 100、TA 102，1535菌株性状和S9活性经鉴定，符合要求，采用平皿掺入法，加S 9与不加S 9进行两次独立试验，设5个剂量，每组做3个皿。

2.2 统计分析 采用SPSS13.0统计软件进行分析。计数数据用卡方检验，计量数据用方差分析进行比较。以P

3.1 小鼠急性毒性试验灌胃后，动物安静少动、进食减少，排出的大便为橙红色。出现中毒现象的小鼠均出现伏地、四肢瘫软、呆滞，继而出现翻转角弓反张，抽搐等症状，最终在1-2d内死亡。剂量越大，小鼠中毒症状越明显，从给药到出现中毒乃至死亡的时间越短。未死亡的小鼠在给药后1-2d开始恢复并逐渐恢复正常。此批次下雄黄的LD50为2.069g/kg。查明此批雄黄的LD50后，我们用2倍于雄黄LD50的雄黄浸出液给药，小鼠也全部死亡，见表1。

表1 小鼠急性毒性试验结果

Tab.1 The mortality rates in mice

组别 阴性对照

0.5%CMC 雄黄1.

55g/kg 雄黄1.

83g/kg 雄黄2.

15g/kg 雄黄2.

53g/kg 雄黄2.

98g/kg 雄黄3.

50g/kg

死亡率% 0 0 60 50 70 90 100

3.2 小鼠骨髓微核试验雄黄各剂量组的微核率与阴性对照组比较，雄黄三个剂量组均有显著性差异(P

表2 小鼠骨髓微核试验结果

Tab.2 The bone mellow cell micronucleus rates in mice

组别 动物数 细胞计数 微核率（%， χ±s）

阴性对照（0.5%CMC-Na） 6 12000 1.42+0.54

环磷酰胺(80mg/kg) 6 12000 28.33+5.41* *

雄黄(250mg/kg) 6 12000 3.00+1.35*

雄黄(500mg/kg) 6 12000 4.40+1.81* *

雄黄(1000mg/kg) 6 12000 7.01+1.52* *

与阴性对照组相比，*P

3.3 CHL染色体畸变试验 24小时和48小时三个剂量与阴性对照组相比均有极显著差异（P20%，明显高于阴性对照组（P

表3 雄黄染色体畸变试验结果（24小时，-S9mix）

Tab.3 The realgar chromosome aberration test results （24小时，-S9mix）

组别 观察中期相

染色体细胞数 染色体结构畸变细胞数

裂隙 断裂 缺失 断片 环状 粉碎化 三辐体 四幅体

染色体数

目畸变数 染色体

畸变率% 染色体结

构畸变率

多倍体 判定结果

阴性对照

（DMSO） 200 6 1 0 2 0 0 0 0 0 1.5 -

阳性对照

（MMC） 200 14 26 9 12 0 0 1 0 0 24* * ++

阴性血清 200 4 0 0 0 0 0 0 0 1 0 -

雄黄浸液低 200 9 6 8 7 2 0 2 0 0 12.5* * -

雄黄浸液中 200 21 20 9 9 0 0 1 0 0 19.5* * -

雄黄浸液高 200 14 17 5 18 0 1 0 0 0 20.5* * -

注：1、主要以不含裂隙的结构畸变率来判定结果（裂隙一般仅作为参考指标，而数目畸变单独列出评价，不计在畸变率中），“-”表示阴性，“+”表示阳性，“++”表示强阳性，并各试验组畸变率分别与阴性对照组（DMSO）进行χ2检验分析，*P

表4 雄黄染色体畸变试验结果（48小时，-S9mix）

Tab.4 The realgar chromosome aberration test results （48小时，-S9mix）

组别 观察中期相

染色体细胞数 染色体结构畸变细胞数

裂隙 断裂 缺失 断片 环状 粉碎化 三辐体 四幅体

染色体数

目畸变数 染色体

畸变率% 染色体结

构畸变率

多倍体 判定结果

阴性对照

（DMSO） 200 5 2 2 0 0 0 0 0 1 2 -

阳性对照

（MMC） 200 22 36 8 5 0 1 5 1 1 28* ++

阴性血清 200 3 2 0 4 0 0 0 0 0 3 -

雄黄浸液低 200 9 8 7 6 0 0 0 0 1 10.5* * -

雄黄浸液中 200 16 13 0 10 0 0 1 0 1 12* * -

雄黄浸液高 200 12 10 10 16 0 0 1 0 2 18.5* * -

注：1、主要以不含裂隙的结构畸变率来判定结果（裂隙一般仅作为参考指标，而数目畸变单独列出评价，不计在畸变率中），“-”表示阴性，“+”表示阳性，“++”表示强阳性，并各试验组畸变率分别与阴性对照组（DMSO）进行χ2检验分析，*P

3.4 Ames试验各剂量组中无论加或不加S 9混合物，试验结果平均回变菌落均未超过自然回变菌落数的2倍，未发现雄黄有直接或间接的致突变作用，雄黄各个剂量组的菌株还出现抑制生长的现象。而阳性组平均回变菌落均超过自然回变菌落数的2倍以上。

表5 雄黄的Ames试验回复突变菌落数结果（第一次）

组别/菌株 TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535

阴性对照（0.5%CMC-Na） 131±29.82 37±5.69 149±20.66 294±13.20 17±4.73

雄黄(100mg/ml) 0±0 0±0 1±0.58 0±0.47 0±0

雄黄(50mg/ml) 1±0.58 0±0 5±2.65 2±1.25 0±0

雄黄(25mg/ml) 11±2.00 3±1.53 7±2.65 15±3.56 2±1.15

雄黄(12.5mg/ml) 51±6.11 17±3.51 42±5.00 74±6.94 5±2.08

雄黄(6.25mg/ml) 93 ±6.11 34±5.86 110±16.64 163±15.54 5±1.15

Dexon 50ug∕皿 887±37.47* * 600±65.05* * 1235±18.50* * 1232±41.38* * 599±12.50* *

2-AF 20ug∕皿 863±11.93* * 663±38.53* * 1140±48.85* * 1204±9.90* * 602±20.52* *

与阴性对照组相比，* *大于阴性对照组两倍以上。

表6 雄黄的Ames试验回复突变菌落数结果（第二次）

组别/菌株 TA97 TA98 YA100 TA102 TA1535

阴性对照（0.5%CMC-Na） 139±18.61 38±9.02 131±20.81 249±14.57 20±2.08

雄黄(100mg/ml) 0±0 0±0 1±1.15 1±1.00 0±0

雄黄(50mg/ml) 1±1.00 0±0 4±1.00 7±2.52 0±0.00

雄黄(25mg/ml) 15±2.00 9±0.58 15±3.06 17±4.58 3±1.15

雄黄(12.5mg/ml) 47±8.50 20±2.52 56±4.58 63±6.66 6±0.58

雄黄(6.25mg/ml) 93±10.26 36±1.73 94±4.36 163±13.20 8±1.53

Dexon 50ug∕皿 913±35.23* * 599±55.00* * 1196±32.51* * 1285±25.42* * 583±16.44* *

2-AF 20ug∕皿 895±14.29* * 671±13.20* * 1086±38.35* * 1211±21.73* * 622±23.18* *

与阴性对照组相比，* *大于阴性对照组两倍以上。4 讨 论

本实验结果表明，雄黄的LD50为2.069g/kg，提示具有一定的毒性作用。现在遗传学的检测根据其检测的遗传学终点可分为4种类型：①检测基因突变；②检测染色体畸变；③检测染色体组畸变；④检测DNA原始损伤。其中，遗传毒性最常规的检测方法有小鼠骨髓微核试验、CHL细胞染色体畸变试验和Ames试验等。

本研究用小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、CHL细胞染色体畸变试验、Ames试验等3项试验，采用体内和体外不同的检测方法对雄黄的遗传毒性进行检测。

小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验主要是对染色体结构完整性改变进行评估，其作为体内遗传毒性检测的首选方法广泛用于评价药物的潜在遗传毒性，凡是能使染色体发生断裂，并延迟到细胞分裂后期，或使染色体和纺锤体联结遭到破坏的遗传损伤，都可用微核试验来检测。结果显示，雄黄三个剂量组与阴性对照组相比，微核率均有显著性差异，且有一定的量效关系。

CHL染色体畸形试验是检测化学物质影响染色体数量和结构的基本方法。染色体畸变试验被多个国际权威组织确定为遗传毒性评价中的标准试验，并出台相应的标准化操作规程指导其实施［8］。染色体畸变试验可分为体外试验和体内试验，目前国内的《指导原则》，也把体外染色体畸变试验（即CHL细胞染色体畸变试验）列为新药临床前遗传毒性检测的一系列标准试验之一。在本试验中，我们根据小鼠急性毒性试验的结果采用浸出液给药的方法，将雄黄浸出液倍比稀释后作为高、中、低剂量，加入到培养液内进行培养。当药物作用于染色体后，对染色体产生损伤如断裂、缺失等则可通过对染色体中期相的观察来判断。我们的实验证明，在阳性对照组中，染色体畸变率远远高于阴性对照组，达20%以上（P

Ames试验可对DNA碱基序列是否改变进行评估，其原理属于基因突变，它是检测环境诱变剂一组实验中的首选实验，广泛应用于致突变、致癌化学物的初筛。其标准株TA 97、TA 98可检测移码突变，TA100可检测碱基置换突变，TA 102兼具上述两种突变类型。在Ames试验中，雄黄各剂量组无论加或不加S9混合物，回变菌落均未超过自然回变菌落数的2倍。反而出现抑制细菌生长的作用，提示雄黄具有抑制细菌生长的作用。

3种方法结合进行检测，有利于增加检测的敏感性与可靠性，掌握更多的遗传损伤特性，从而更全面、准确地反映受试物的遗传毒性。综上所述，本批次的雄黄具有一定的遗传毒性。

参考文献

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［2］ 白冰，李秀芳，杨堃，等.大鼠口服雄黄后砷的药物动力学与毒代动力学研究［J］.中国药师，2010，13(5)：626-629.

［3］ Recio L，Hobbs C，Caspary W，et al.Dose-response assessment of four genotoxic chemicals in a combined mouse and rat micronucleus (MN) and Comet assay protocol.J Toxicol Sci，2010，35(2)：149-62.

［4］ 袁伯俊，廖明阳，李波.药物毒理学实验方法与技术［M］.北京：化学工业出版社生物医药出版分社，2007：293.

［5］ 曹佳，林真，余争平.微核试验［M］.北京：军事医学科学出版社，2000：92-94.

［6］ Lee NJ，Yang BC，Jung YR，et.al.In vitro and in vivo genotoxic effects of somatic cell nuclear transfer cloned cattle meat.Food Chem Toxicol，2011 Sep；49(9)：2273-8.Epub 2011 Jun 21.

［7］ Loveless SE，Slezak B，Serex T，Lewis J，Mukerji P，O''Connor JC，et.a1.Toxicological evaluation of sodium perfluorohexanoate.Toxicology，2009 Oct 1；264(1-2)：32-44.Epub 2009 Jul 24.

［8］ ICH：Intermational conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use(ICH) S2(R1)：Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use，2008.