角膜损伤对BMSC增殖的影响

健全的眼表上皮连同一个稳定的角膜前泪膜是维持角膜生理功能的组织解剖学基础。角膜上皮结构完整、功能正常对视力有重要影响。临床常见的疾病，如酸碱化学伤、自身免疫性疾病、炎症等，均可造成眼表不同程度的损伤，严重的可以导致眼表组织的广泛破坏，引起持续的角膜上皮缺损，最终导致失明。目前同种异体角膜移植是角膜性失明主要的治疗手段，但角膜移植手术通常会因严重的免疫排斥反应而失败，且适合的供体组织十分短缺。尽管大量研究证实角膜缘干细胞可作为种子细胞分化为角膜上皮细胞［1-2］，但细胞来源的有限性使其应用受到限制。到目前为止，国内外已有很多学者研究证实骨髓间充质干细胞(bone marrowme senchymal stemcell，BMSC)可以向角膜上皮细胞转分化，但是诱导培养的类角膜上皮细胞传代后增殖能力明显降低，大部分细胞在传代后死亡［3-4］。本实验建立持续性角膜上皮缺损模型，旨在观察BMSC在组织损伤后体内病理生理环境下增殖能力的变化，若能获得增殖能力较强的BMSC，则作为后续实验的种子细胞，诱导分化为类角膜上皮细胞，以期待获得更具优势的种子细胞，用于组织工程角膜。

1材料与方法

1．1实验动物与分组

健康雄性Wistar大鼠(购自南方医科大学实验动物中心)40只，4周龄，体质量200～210g，室温环境饲养。术前经荧光素钠染色裂隙灯下检查，角膜无异常。随机分为8组，每组5只，按每天处死一组大鼠的先后顺序分别命名为缺损组(A、B、C、D、E、F、G)和对照组。

1．2主要试剂和仪器

DMEM/F12(Hyclone，USA)，胎牛血清(四季青，中国)，胰蛋白酶(Gibco，USA)，EDTA(乙二胺四乙酸二钠，AMRESCO分装)，RNase(MBI，USA)，碘化丙啶(Sigma，USA)，CO2培养箱(HealForceHF121UV)，LEOCADMILHC型倒置显微镜(Leica公司，德国)，手术显微镜LEICAMEL53型(WILDLEITZ公司，瑞士)，裂隙灯显微镜、角膜环钻(苏州明仁医疗器械厂)。

1．3方法

1．3．1大鼠持续性角膜上皮缺损模型的建立

腹腔注射3g•L－1戊巴比妥钠(30mg•kg－1)全身麻醉缺损组大鼠，待其角膜反射消失后，用碘伏消毒大鼠左眼，并铺无菌洞巾，开睑器开睑，4g•L－1盐酸奥布卡因滴左眼进行眼表麻醉，在眼科手术显微镜下用直径3．5mm的环钻于角膜中部做表层压痕，荧光素钠染色后用生理盐水冲洗，显露环痕后用半锐度月形刀刮去环内全部上皮，然后用荧光素钠染色，在裂隙灯显微镜下观察并拍照，如呈直径3．5mm均匀着色圆盘状上皮缺损区，即造模成功。术后生理盐水冲洗，涂金霉素眼膏，氧氟沙星滴眼液滴术眼，3次•d－1，预防感染。为了达到实验需要，每天按照上述方法对缺损组大鼠左眼行角膜上皮刮除术，建立持续性角膜上皮缺损模型。第1次术后1d处死缺损组A组大鼠，然后对剩余缺损组大鼠左眼行角膜上皮刮除术;第2次术后1d处死缺损组B组大鼠，然后对剩余缺损组大鼠左眼行角膜上皮刮除术，依此类推连续7d，并在无菌条件下获取各组BMSC。

1．3．2BMSC的分离与培养

将大鼠以3g•L－1戊巴比妥钠过量麻醉处死后用体积分数75%乙醇全身浸泡消毒10min。于超净台上无菌条件下分离出股骨和胫骨，剔除肌肉和骨膜，将骨骺端剪去，暴露出两端骨髓腔，用5mL注射器抽取完全培养基反复冲洗骨髓腔，将冲洗液收集到无菌离心管中，并用滴管反复吹打制成单细胞悬液，900r•min－1离心5min，弃去上清液，重悬以109L－1的细胞密度接种于25cm2的培养瓶中，置37℃、含体积分数5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。2d后首次全量换液，以后每3d全量更换新鲜培养基，待细胞达70%～80%融合时用2．5g•L－1胰酶消化，按体积比12比例进行传代培养。倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况。

1．3．3流式细胞仪检测阳性表达率

取第3代生长状态良好的BMSC，胰酶消化后制成单细胞悬液，用PBS离心洗涤2次，900r•min－1离心5min，每管依次加入抗大鼠抗体CD29、CD34、CD44、CD45，4℃孵育30min，加入荧光标记的二抗，4℃孵育30min。体积分数10%甲醛固定，流式细胞仪测定各类抗原的阳性表达率。

1．3．4BMSC成脂诱导分化

取第3代生长状态良好的BMSC，按20×106L－1的密度均匀接种于六孔细胞培养板中，待细胞达100%融合时，移去旧的培养液，每孔加入2mL成脂诱导液A(DMEM+体积分数10%FBS、双抗、谷氨酰胺、胰岛素、IBMX、地塞米松、吲哚美辛)开始诱导。3d后更换为成脂诱导液B(DMEM+体积分数10%FBS、双抗、谷氨酰胺、胰岛素)进行维持，24h后再更换为成脂诱导液A，如此进行3个循环。此时细胞内空泡出现较多，但比较小，再用成脂诱导液B维持4d，小空泡融合变大。吸去诱导液B，40g•L－1多聚甲醛固定，油红O染色，倒置显微镜下拍照。

1．3．5BMSC的细胞周期检测

分别取对照组和缺损组第3代生长状态良好的BMSC，胰酶消化后制成单细胞悬液，用PBS离心洗涤2次，900r•min－1离心5min，弃上清，用4℃预冷的体积分数70%乙醇重悬固定，－20℃冰箱放置备用。用前离心去除固定液，加100μLRNase，37℃水浴30min，再加入400μL碘化丙啶染色液混匀，4℃避光30min，流式细胞仪检测细胞周期。

1．4统计学方法

实验获取的数据用SPSS17．0统计学软件进行计量资料的单因素方差分析，并进一步行多个样本均数间的两两比较SNK-q检验，检验水准α=0．05。

2结果

2．1大鼠角膜上皮缺损情况

造模后0h随机选取1只缺损组大鼠，对其左眼行荧光素钠染色，裂隙灯显微镜下观察显示缺损区均匀着色，形状为规则的圆盘状;造模后24h再次对其左眼行荧光素钠染色，裂隙灯显微镜下观察显示:角膜上皮缺损区面积明显缩小，但尚未愈合(图1)。

2．2BMSC形态学观察

倒置相差显微镜下观察48h可见部分细胞贴壁，外观呈纺锤形或多角形，有良好折光性;细胞培养至第7天数量明显增多，形态变为长而扁平的梭形(图2);细胞培养第10天极性明显，细胞排列紧密，呈漩涡状或鱼群状排列。

2．3BMSC表面标记物的表达

流式细胞仪检测结果显示，BMSC的CD29、CD44均呈高表达，阳性率分别为99．57%、98．35%;而CD34、CD45阳性表达率则极低，分别为1．20%、2．58%，符合BMSC的特征(图3)。

2．4BMSC成脂诱导分化鉴定

BMSC加入成脂诱导剂后16d，诱导而成的脂肪细胞中出现串珠样脂滴，经油红O染色呈鲜红色(图4)。

2．5各组BMSC细胞周期检测结果

流式细胞仪检测所得数据(表1)经单因素方差分析，结果示B组、D组S期及G1期细胞百分数与A、C、E、F、G组及对照组的差异均有统计学意义(均为P＜0．05)，但B、D组S期及G1期细胞百分数差异均无统计学意义(均为P＞0．05)，A、C、E、F、G组及对照组间S期及G1期细胞百分数均值差异均无统计学意义(均为P＞0．05)。统计学分析结果显示:B组S期细胞所占比例较对照组平均增加近13%，D组增加近14%;S期为DNA合成复制期，反映细胞群体增殖能力，说明B、D组BMSC增殖能力显著提高。

3讨论

组织损伤发生时，BMSC会在炎症反应所释放的细胞因子(如IL-1、IL-9、IL-12、粒细胞集落刺激因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子等)的作用下自身增殖［5］，随后被动员到外周血循环中，并向损伤组织处迁移、识别和定位，在损伤组织微环境的作用下定向分化为相应组织的成熟细胞，实现组织的修复;而通过各种途径引入体内的外源性BMSC，也会定向聚集至损伤处，发挥治疗作用。很多学者现已证实体内BMSC的动员迁移是由于体内动员剂的趋化作用所引起，如粒细胞集落刺激因子［6］、基质细胞衍生因子-1［7］、单核细胞趋化蛋白-1［8］等。在正常的机体内，这些动员剂的含量维持在较低水平，不发挥迁移趋化作用，当组织损伤发生时，会引发炎症、缺血、缺氧等病变，进而使动员剂的含量上调，发挥迁移趋化作用。

本实验制作了角膜上皮持续损伤模型，细胞周期检测结果显示:对照组BMSCS期细胞和G1期细胞百分数的均值分别为4．00%±2．40%、92．85%±3．61%;在角膜上皮持续损伤的第3天和第5天BMSCS期细胞百分数的均值分别增加到16.76%±4．49%、17．95%±2．77%，G1期细胞百分数的均值分别降低为72．26%±8．81%、71.33%±5．30%，与对照组细胞的差异均有统计学意义，说明在角膜上皮持续损伤的第3天和第5天BMSC增殖能力明显提高。角膜上皮损伤后的愈合过程是多重因素参与的复杂过程，包括上皮细胞黏附、迁移，角膜缘干细胞增殖分化，炎症反应等等。角膜上皮持续损伤的第3天和第5天BMSC增殖能力明显增高很可能就是因为机械损伤所引发的炎症反应所致，由于炎症反应会释放各种生长因子、细胞因子、趋化因子等，这些因子的分泌在损伤的第3天达到高峰，间接或直接刺激BMSC增殖，由于损伤持续存在，炎症反应所释放的各种因子会被消耗，导致第4天BMSC的增殖能力下降，随后由于损伤的加剧，炎症反应更加强烈，于第5天释放更多的炎症因子，再次刺激BM-SC，使其增殖能力增强。BMSC又称骨髓基质干细胞，对骨髓中的造血干细胞不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子(如IL-6、IL-11、巨噬细胞集落刺激因子及干细胞因子等)来支持造血［9-10］，BMSC的首次增殖为造血干细胞提供更多的生长因子，促进其分化为血细胞前体细胞，最终使血液中白细胞数量增加，趋化迁移到组织损伤处发挥吞噬、分泌抗体等作用，参与损伤组织的修复;再次增殖的BMSC也许会被动员到外周血，在趋化因子的作用下迁移定位到损伤角膜上皮处，参与角膜上皮的修复。

本实验所用的造模方式安全，成模率高。但是，BMSC细胞周期的改变是间隔24h观察所得，因此本实验研究所得结果尚不能作为最佳结果，今后将做进一步的研究，使这一理论趋于完善。