微波-酶法提取远志总皂苷的工艺研究

摘 要:目的:优选远志总皂苷的微波-酶法最佳提取工艺条件。方法:用乙醇和水为溶剂,以远志提取液中总皂苷提取物的收率为指标,采用3因素3水平的正交设计法和单因素法对微波-复合酶法提取工艺条件进行优选。结果:实验条件下的最优工艺条件为:在pH=7,45℃条件下,酶解时间为1h,控制料液比1∶25,微波功率255W,提取4min,乙醇浓度95%,酶浓度为0.30%,远志总皂苷的提取率达2.03%;用显微镜观察到微波、复合酶破坏了远志细胞壁的结构;薄层色谱分析表明微波未破坏皂苷结构。结论:与直接传统乙醇回流提取法相比,微波-酶法提取能大大缩短提取时间,降低有机溶剂用量,并能提高远志总皂苷的收率。

关键词:微波-酶提取法;远志;总皂苷;正交实验

中图分类号:R284.2 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)01-0097-04

Microwaveenzymatic Extraction Process of

Total Saponins in Polygala

WANG Yingli,WANG Yunting

(Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Taiyuan 030024 ,Shanxi,China)

Abstract:Objective:Optimization the extraction conditions of total saponins in Polygala using microwaveenzymatic extraction method.Methods:Using ethanol and water as solvent , the yields of total saponins in Polygala as indicator, using three factors and three levels of the orthogonal design and single-factor method of microwaveenzymatic extraction method, the extraction process conditions were optimized.Results:Under the experimental conditions the optimum process conditions are as follows: pH = 7,45 ℃, 1h hydrolysis time, the ratio ofmaterial to liquid is 1:25, microwave power is 255W, extraction time is 4min, the concentration of ethanol is 95% , enzyme concentration is 0.30%, the total extraction rate of total saponins in Polygala is 2.03%; From the microscope view the microwave and enzyme destroyed the cell wall of polygala; through the thin-layer chromatography plate, the microwave did not damaged the structure of saponins. Conclusion: Comparing to traditional method of direct ethanol extraction, microwave - enzymatic extraction method can greatly shorted the extraction time, reduce the amount of organic solvents and can improve the yields of total saponins in Polygala.

Key words:microwaveenzymatic extraction method;Polygala;total saponins;orthogonal experiment

远志科远志属植物全世界有500多种,分布于欧亚大陆和美洲的亚热带和温带地区。我国有42种8变种,资源较丰富[1]。远志为常用中药之一,药用历史悠久,在《神农本草经》中列为上品。《中国药典》2005年版一部规定其来源为远志(Polygala tenuifolia Willd.)或卵叶远志(Polygala sibirica L.)的干燥根[2]。性苦、辛、温。归心、肾、肺经。有安神益智、祛痰开窍,消散臃肿的功效。远志中富含三萜皂苷、口山酮、寡糖酯类化合物,以及香豆素、木质素、黄酮、生物碱、酚类配糖体等[3]。研究表明,远志镇静、祛痰等功效的有效成分为远志皂苷。

皂苷的传统方法中渗漉法提取率较高,操作简单,提取液杂质少,但是溶剂消耗过大,提取周期较长。乙醇回流法方法简便,工艺条件易于控制,但提取率较低。微波是一种非电离的电磁辐射,被辐射物质的极性分子在微波电磁场中快速转向及定向排列,从而产生撕裂和相互摩擦引起发热,微波提取技术具有快速、溶剂用量少、提取率高、成本低、质量好等许多优点[4]。纤维素酶能水解结构致密的植物细胞壁,有利于细胞内皂苷等有效成分的溶出。将微波提取法与生物酶提取法相结合用于提取远志总皂苷,由于提取温度低,提取时间短,在显著提高远志总皂苷提取率的同时,使远志中的有效成分得以溶出而不分解,保持其中的药用功效。本文用微波一酶法提取远志总皂苷,用红外分光光度法测定远志总皂苷含量,优选出了最佳的提取工艺条件。

1 实验材料

1.1 主要仪器

VIS-723G可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);FA/JA1004万分之一电子天平(上海精密科学仪器有限公司);ZF-90暗箱式紫外透射仪(λ=365,上海顾村电光仪器厂);KD-25B-C电脑烧烤微波炉(北京美的有限公司);PHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司);HX-200A高速中药粉碎机(浙江省永康市溪岸金具厂);HH-Z电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)。

1.2 药材及试剂

远志药材经GMP认证(由安国市京兴药业有限责任公司提供),经本院中药鉴定教研室裴香萍老师鉴定;远志皂苷化学对照品,供含量测定用(编号111572―200702,由中国药品生物制品鉴定所提供);SPE―001复合酶(由夏盛实业集团有限公司提供,XP≥l500万);香草醛、高氯酸、冰醋酸、95%乙醇、甲醇、石油醚(30～60℃)均为分析纯;硅胶G薄层板(厚度:0.20～0.25mm;规格:30mm×100mm;青岛海洋化工厂分厂)。

2 分析测定方法

2.1 远志药材脱脂

取适量干燥的40目远志药材粉末,在常压,45℃水浴中用石油醚依次脱脂两次,料液比分别是1∶5和1∶3;连续回流脱脂回收废液石油醚。脱脂率均值为22%,脱脂后的远志粉末备用。

2.2 远志总皂苷含量的分光光度法测定

2.2.1 远志总皂苷对照品和供试品溶液的制备

精密称取远志皂苷元对照品,加甲醇制成0.7mg/mL的溶液,定容于25mL容量瓶中作为对照品溶液。

称取已脱脂的远志粉末2g,置于三角烧瓶中,加入一定浓度的乙醇溶液50mL,用微波辐射30s,间隔lmin,再辐射30s,重复至总辐射时间达到实验规定时间,微波功率30%为255W。滤过后将提取液用蒸发皿蒸干,用甲醇将其溶解,过滤定容于25mL容量瓶中,作为供试品溶液。

2.2.2 标准曲线的制备

精密吸取供试品溶液和对照品溶液20μL分别置于具塞试管中,经显色后,在400～600nm扫描测定最大吸光度。经测定两溶液均在568nm处有最大吸收波长。

精密吸取20μL,40μL,60μL,80μL,100μL,120μL对照品溶液于6支具塞试管中,与60℃水浴加热挥发干,再分别向试管中加入0.2mL,5%香草醛-冰醋酸(新鲜配制),0.8mL高氯酸,密塞。将试管放入60℃的水浴锅中恒温15min,再将其放入冰水混合物中冷却5min,取出各加5ml冰醋酸摇匀静置15min。在568nm波长处测定吸光度,随行试剂作空白参比[5]。以吸光度A为横坐标,远志皂苷元含量C(mg)为纵坐标绘制标准曲线,求得回归方程C=0.0594A+0.0045,r2=0.9864。

2.2.3 样品溶液的含量测定

精密吸取上述配制好的样品溶液20μL于具塞试管中,按照对照品显色方法配制,测定吸光度,用回归方程计算浓度,即远志总皂苷含量以远志皂苷元计。

3 实验结果与分析

3.1 远志总皂苷提取的单因素实验

3.1.1 料液比的选择

在微波功率255W时,微波提取时间2min,乙醇浓度95%的条件下,考察料液比对总皂苷提取率的影响,结果如图1。

图1表明,料液比为1∶25时总皂苷的提取率较大,提取较充分,因此料液比选1∶25比较合适。

3.1.2 提取时间的影响

在微波功率255W,料液比1∶25,乙醇浓度65%的条件下,改变微波时间考察远志皂苷提取效果,结果如图2。

由图2可以看出,从2min到4min,提取率有很大提高,4min后,提取率的增幅很小,说明微波4min时提取的远志总皂苷已经比较彻底,再进一步提取不会有很大的提高。所以从节能方面考虑,提取时间4min最佳。

3.1.3 酶用量的选择

在微波功率255W,微波时间2min,乙醇浓度95%的条件下,改变酶用量考察远志皂苷提取效果,酶用量一般为原药材干物质重量0.1%～1%之间,实验结果如图3。

由图3可以得出,随着酶用量的增大,总皂苷提取率有逐渐下降的趋势。所以酶浓度为0.3%时,提取率最佳。

3.2 微波一酶法提取工艺正交实验

在单因素实验的基础上,选取酶用量(A)、提取时间(B)、乙醇浓度(C)3个因素,每个因素3个水平,按L9(34)正交表进行试验,因素水平安排见表1。称取40目已除脂的远志粉末2g,在45℃水中浸泡30min,再缓缓加入活化后的酶溶液(酶浓度为0.003g/mL,在45℃水浴中活化10min,加2mL酶溶液为药材干重的0.3%,4mL即为0.6%),并轻轻搅拌,在45℃水浴中酶解1h。考察酶对提取效率的影响。正交实验结果如表2,方差分析见表3。

由表2、表3可知,各因素对远志提取液中皂苷的影响程度为C>A>B,即乙醇浓度>酶用量>提取时间;酶用量、提取时间和乙醇浓度都具有显著性。最佳提取方案为A2B2C3,即酶用量2ml,提取时间4min,乙醇浓度95%,总皂苷提取率为2.028%。

3.3 微波一酶法对远志细胞显微结构的影响

远志总皂苷分布于远志韧皮薄壁细胞中[6],在显微镜下对远志原药粉末,脱脂后远志粉末、微波及微波一酶法提取后的残渣进行观察,其显微结构变化如图4所示。

由图4a观察到,未经处理的远志药材粉末的薄壁细胞中,含有许多油脂滴。经脱脂后的远志薄壁细胞中油脂滴已经很少(如图4b所示),用石油醚脱脂可将远志中的其它无用成分脱去,有利于进一步提取。由图4c观察到,脱脂后的远志细胞,经微波提取后,由于微波的破坏作用使大多细胞壁都破裂,有利于细胞中远志总皂苷的提取。再经酶处理后的细胞壁受到更大的破坏(如图4d所示)。

微波场能使细胞壁破裂,细胞膜的透过选择性消失,细胞中皂苷能自由通过细胞膜。复合酶也可以分解细胞的纤维素,这样使细胞中皂苷成分易于被溶剂溶出,从而更进一步提高远志总皂苷的提取效率。

3.4 远志总皂苷的薄层色谱鉴定

将传统回流提取和微波一酶法提取的总皂苷做薄层色谱鉴定,分别吸取两种远志总皂苷供试品溶液6uL,点于同一硅胶G薄层板,以氯仿∶甲醇∶水(65∶35∶10)10℃以下分液漏斗萃取后,静置,取下层溶液为展开剂,在立式展开槽中饱和20min,展开,展距为8cm,取出,晾干,喷以20%H2SO4乙醇溶液,在105℃烘箱中加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(365nm)下检视,观察可知两种方法提取效果基本一致,两种提取方法提取出的皂苷成分一致,微波-酶法对总皂苷无影响,见图5。

4 结 论

通过实验,得到了微波-酶提取远志总皂苷的最佳工艺条件:取脱脂后远志粗粉,加入95%乙醇,料液比为1∶25,在微波功率为255W,辐射时间为4min,远志总皂苷提取率达2.03%。

用显微镜观查到微波、酶都一定程度破坏了远志细胞壁,从而提高远志总皂苷提取率;通过薄层色谱板观察到微波提取和传统提取法一样,说明未破坏皂苷结构。

微波-酶法提取远志总皂苷,不仅能缩短提取时间、提高皂苷产率,而且能减少实验器材,降低实验成本,在很多方面优于传统的直接乙醇回流加热提取法。对于工业化提取具有积极的指导意义。

参考文献

[1] 张培轩,段瑞,黄鹏.中国远志属药用植物资源及地理分布[J].基层中药,2002,16(6):42-43.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典•一部[S].北京:化学工业出版社,2005:107.

[3] 傅晶,张东明,陈若芸.远志属植物的皂苷类成分及其药理作用研究进展[J].中草药,2006,37(1):144.

[4] 龚盛昭,杨卓如.微波提取黄芩苷的协同效应研究[J].精细化工,2003,20(7):435-437.

[5] 梁戈亮,林书玉,刘东.超声提取一分光光度法测定远志总皂苷的含量[J].现代生物医学进展,2008,8(1):104-105.

[6] 滕红梅,李金亭,胡正海.远志根的发育解剖学研究[J].西北植物,2008,28(1):90-96.