布鲁氏菌缺失组建

布氏杆菌病(Brucellosis)是一种世界范围的广泛传播并导致社会经济和卫生安全问题重要的细菌性疾病之一，其发病率正在部分地区增加，特别是一些发展中国家，譬如:整个地中海国家、中东、欧亚大陆和非洲的一些地区以及拉丁美洲［1］。布病严重危害着畜牧业的发展，尤其是牛、羊、猪等主要家畜感染布病后，可造成大量流产、不孕、不育、死胎等致使牲畜数量锐减。如青海省每年流产牛犊达6万余头。新疆每年因布病流产、空怀等少生幼畜达100万～140万头［2］。目前尚没有有效的防治手段［3］，亦没有理想的人用疫苗可以使用［4］。布鲁氏菌是兼性胞内寄生菌［5］，主要定居在巨噬细胞和胎盘滋养层细胞这两类宿主细胞。胎盘中含有大量的赤藓醇，赤藓醇能够促进布鲁氏菌的生长，因此，布鲁氏菌对怀孕母畜胎盘具有显著的亲嗜性，能损伤滋养细胞引起母畜的流产［6］。目前，关于布鲁氏菌引起流产的致病机制研究较少，关于布鲁氏菌侵染滋养细胞的作用机理研究尚不清楚，本研究通过同源重组的方法构建布鲁氏菌2308ery启动子缺失株并进行鉴定，该缺失株不仅为布鲁氏菌侵染滋养层致病机制奠定了基础，也为疫苗株的改造提供了有效的参考依据。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验材料布鲁氏菌2308株、枯草芽孢杆菌B115株、DH5α及pGEM－7zf(+)自杀载体均由作者研究室保存;pMD19－T载体、T4DNA连接酶、限制性内切酶SphⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ均购自TakaRa公司。

1.1.2试剂琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、高纯度质粒小提中量试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司;氨苄青霉素够自美国Sigma公司。DNAMarker购自大连宝生物工程有限公司。

1.1.3仪器PCR仪(BIO－RAD);UVP凝胶成像系统;超速离心机(eppendorf，centrifuge－5415D);恒温培养箱(DNP－9162);恒温摇床(HZQ－X100);高速冷冻离心机(Sigma，2－16K);水浴锅(DKB－501A);全自动高压蒸汽灭菌罐;超低温冰箱;电泳仪;超净工作台;分光光度计Lambda3B(UV/V/S);电转仪(eppendorf);生物安全柜(Esco，ClassⅡ－biohazardsafecabi-net);电子秤(Sartoriusgroup，AcculabALC－1100.2);微量移液器(eppendorf)。

1.1.4培养基BrucellaBroth培养基以及BrucellaAgar培养基均购自美国BctonDickinson公司;胰大豆肉汤和胰大豆琼脂培养基购自美国BD公司。

1.2方法

1.2.1引物实验所用的引物均由上海生工生物技术服务有限公司合成。引物序列见表1。表1PCR引物及序列

1.2.2同源臂的扩增上游臂的扩增，用引物ery－上－上游、ery－上－下游以2308株为模板扩增上游同源臂，PCR条件为95℃4min，94℃40s，60℃40s，72℃80s，72℃7min，然后1%的琼脂糖凝胶电泳检测。连接T－载体，送华大基因测序，同源性为100%。下游臂的扩增，用引物ery－下－上游、ery－下－下游以2308株为模板扩增下游同源臂，PCR条件95℃4min，94℃40s，61℃40s，72℃80s，72℃7min，然后1%的琼脂糖凝胶电泳检测。连接T－载体，送华大基因测序，同源性为100%。

1.2.3同源重组质粒pGEM－7zf－Δery－sacB的构建以灭活的布鲁氏菌2308株为模板，用引物ery－上－上游、ery－上－下游、ery－下－上游、ery－下－下游扩增出ery启动子基因侧翼序列的DN段，连接T载体转化进入DH5α感受态细胞，初步进行PCR验证再经测序正确后，分别用SphⅠ/XhoⅠ双酶切上臂和pGEM－7zf(+)自杀载体，回收目的片段，将得到的上臂和线性化的自杀载体连接，鉴定正确后再分别用XhoⅠ/BamHⅠ双酶切下臂和带有上臂的重组质粒，回收目的片段，将得到的下臂基因和带有上臂的线性化的重组质粒连接。经过测序鉴定正确的重组质粒命名为pGEM－7zf－Δery。用引物SacB－上、SacB－下扩增出sacB基因，克隆枯草芽孢杆菌sacB基因连接T载体，测序正确后，分别用BamHⅠ单酶切含有上下游同源臂的重组质粒pGEM－7zf－Δery和T－sacB，将得到线性化的sacB基因与线性化的含有上下游同源臂的重组质粒pGEM－7zf－Δery连接，构建成连接上sacB基因的同源重组质粒送华大基因测序，将测序正确后的同源重组自杀质粒命名为pGEM－7zf－Δery－sacB。

1.2.4布鲁氏菌ery启动子基因缺失突变株的筛选及鉴定布鲁氏菌2308株电转化感受态细胞的制备参照参考文献［7］，取5～10μg构建好的同源重组质粒pGEM－7zf－Δery－sacB加入到100μl制备好的2308株感受态细胞中吹打混匀，冰上放置15min，移入2mm的电击杯中，以E=2.5KV/cm电击，电击后立即将电击杯放入冰上1min然后将37℃预热的1mLBrucellaBroth培养基加入到电击杯中混匀，取出放入EP管中，37℃摇床培养24h后8000r/min离心2min，弃去多余的液体，剩余80～100μl的液体与菌体吹打混匀先涂布于100mg/LAmpr抗性培养基，37℃培养24～48h，挑取单菌落培养鉴定阳性后再涂布含7%的蔗糖BrucellaAgar培养基上，分别进行同源重组的单、双交换子筛选。对同源重组双交换子进行PCR鉴定和稳定性检测。

1.2.5布鲁氏菌ery基因缺失突变株mRNA水平的检测按常规方法提取2308株Δery缺失株总RNA，将提取的总RNA反转录，然后用dberyA上、下游引物PCR扩增eryA基因，检测eryA是否能够转录。

2结果与分析

2.1上下游同源臂扩增鉴定以2308株为模板，扩增出上游同源臂目的条带如图1大小为1227bp;扩增出上游同源臂的目的条带如图2，大小为1037bp，目的条带大小均与预期结果一致。

2.2同源重组质粒pGEM－7zf－Δery－sacB的酶切鉴定将pGEM－7zf－Δery－sacB质粒分别用SphⅠ/XhoⅠ、XhoⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ酶切，其中上游臂为1227bp、下游臂为1037bp、sacB为1475bp。酶切结果与预期结果一致。结果如图3。

2.3布鲁氏菌ery启动子基因缺失株同源重组单交换子和双交换子的筛选经过电转化的布鲁氏菌37℃培养24h后均匀涂布于含有100mg/L氨苄抗性的BrucellaAgar培养基上，挑取单交换子于BrucellaBroth培养基中培养24h后用检测引物jcery做菌液PCR检测，缺失ery启动子序列大小为613bp，未缺失前ery启动子序列的大小为1088bp结果与预期相符，如图4。将阳性菌离心后再涂布于含有7%蔗糖的BrucellaAgar培养基上进行双交换子的筛选，挑取单菌落用jcery引物做菌液PCR检测，如图5。将二次重组后的菌灭活后用jcery引物扩增基因，连接T－载体后送华大基因测序，用测序后的基因序列和构建的上下游同源臂序列作对比，与同源臂序列上的目的基因的同源性为100%共计613bp。

2.4布鲁氏菌2308株Δery启动子缺失株的PCR检测以亲本株2308为阳性对照，用ery－上、下游引物PCR扩增2308株Δery启动子缺失株，不能扩增出对应的目的条带，如图6所示。

2.5布鲁氏菌2308株Δery缺失株的RNA水平检测按常规方法提取2308株Δery缺失株总RNA，将提取的总RNA反转录，然后用引物dberyA上:5’GGATCCTCAGCCAT-GCGTGAAAAAGG3’和dberyA下:5’CTCGAGG-GAAGCGAGTTTGTCCCAGA3’做PCR扩增eryA基因，检测结果如图7，从图中我们可以看出因启动子缺失2308株Δery启动子缺失株的总RNA未能反转录成cDNA。因此在以2308株Δery启动子缺失株反转录成的CDNA为模板时未能扩增出eryA基因的条带。已证明我们成功地缺失了2308ery基因的启动子。

2.6布鲁氏菌2308Δery基因缺失株稳定性检测2308Δery基因缺失株经鉴定后，常规传代培养至10代，PCR鉴定发现在10代以内能够稳定遗传，没有发生回复性突变，如图8。

3讨论

流产布鲁氏菌2308株能够引起怀孕母牛胎盘坏死及间质性乳腺炎［8］。FélixJ．Sangari等［9］对B.abortus2308株的赤藓醇基因研究显示，ery操纵子包括4个阅读框。布鲁氏菌通过ery操纵子可表达代谢赤藓醇的蛋白，是布鲁氏菌利用胎盘中赤藓醇的主要途径。而赤藓醇又有刺激布鲁氏菌在滋养层细胞中生长的作用。EwaltDR等［10］，共研究231株B.abortus菌的ery操纵子的四个阅读框基因，其中包括B.abortus1，2，4型、强毒株2308和疫苗株S19及RB51，研究表明除S19疫苗菌株有缺失外，其余的B.abortus菌株皆有完整的ery基因存在。S19株从eryc的第480位到eryd的第255位缺失，虽然S19号菌株对牛来说是低毒的，但接种怀孕母牛仍可引起流产。2308ery操纵子包括4个紧密排列的基因，ery操纵子的启动子在eryA的5’端。启动子是指RNA聚合酶识别、结核和开始转录的一段DNA序列RNA聚合酶起始转录需要的辅助因子成为转录因子，它的作用或者是识别DNA的顺式作用原件，或是识别其他因子，或是识别RNA聚合酶。大量的试验研究主要集中于布鲁氏菌与巨噬细胞、树突细胞及非吞噬细胞之间的相互作用。由于缺少适合的牛胎盘滋养层细胞系，才使得有关牛布鲁氏菌是如何侵入机体的靶细胞一胎盘滋养层细胞二者之间关系的研究成果较少［8］。我们的实验以2308ery启动子为靶基因，利用同源重组原理构建2308ery启动子缺失株，为后期研究该缺失株对赤藓醇的敏感性以及对滋养层细胞的亲嗜性奠定基础。布鲁氏菌的基因功能研究得力于其突变株的构建。由于很多常见载体在布鲁氏菌中不能复制［11］，这些载体均可作为自杀载体来构建布鲁氏菌的突变株。我们选择质粒pGEM－7zf(+)作为自杀载体，sacB基因作为负筛选标记，该基因编码的果糖蔗糖酶能将蔗糖水解为果糖并生成大分子质量的果聚糖，在革兰氏阴性细菌周质空间累积，导致细胞停止生长，可以用来作为同源重组双交换的筛选标记［12］。该基因作为革兰氏阴性菌中的一个重要反向筛选基因避免了用抗生素抗性基因作为负筛选标记时须逐个验证是否抗性基因丢失且工作烦琐容易出现假阳性的缺点［13，14］。实验结果表明:利用这类含有反筛基因的克隆载体可以高效构建布鲁氏菌突变株。而适当提高蔗糖浓度更有利于sacB基因反筛选标记的功能，但蔗糖浓度不宜超过8%。2308ery启动子基因缺失株不仅为布鲁氏菌致病机制的研究奠定了基础，也为疫苗株的改造提供了有效的参考依据。