单细胞激光拉曼光谱检测重组大肠杆菌细胞表达甲酸脱氢酶

摘 要 甲酸脱氢酶（FDH，EC1.2.1.2）在工业生产中有重要的应用价值，工业上应用的FDH可以通过构建高水平表达重组FDH蛋白的基因工程菌生产，用分子生物学的方法检测重组蛋白的高效表达和积累操作繁杂，耗时耗力且需要破碎细胞。为了寻找一种简单快速，不需破碎细胞， 且能实时检测FDH重组蛋白在基因工程菌中表达情况的方法，本研究应用单细胞激光拉曼光谱分析技术（LTRS），研究IPTG诱导不同时间后甲酸脱氢酶重组蛋白（FDH）在大肠杆菌细胞中的表达水平。结果表明，FDH的特征峰1004，1355，1455和1667 cm

䥺Symbolm@@ 1随着IPTG诱导时间的延长而增强，说明在诱导培养过程中FDH重组蛋白在重组大肠杆菌细胞中表达并积累，这4个峰强的增加值所反映的FDH表达量与SDS-PAGE电泳分析结果一致。实验结果证明，LTRS是快速有效检测单个大肠杆菌活细胞体内重组FDH实时表达的一种非入侵方法。

关键词 大肠杆菌； 甲酸脱氢酶； 重组蛋白表达； 单细胞； 拉曼光谱

1 引 言

甲酸脱氢酶（Formate dehydrogenase，FDH，EC1.2.1.2）是广泛存在于各种生物体中一种依赖NAD+的重要酶[1]。研究表明，NAD+依赖型FDH在甲基营养菌生物合成和能量代谢中起重要作用。甲基营养菌能利用和代谢氯化物，氯化物在甲基营养菌细胞中首先被氧化为甲醛，然后进入到异化途径， 经过一系列反应， 最终氧化生成CO2，或进入同化途径， 转变为细胞的组成成分。作为甲醛异化代谢的最后一步关键酶，FDH将甲酸氧化为CO2，同时将NAD+还原成NADH，还原的NADH为这些微生物提供了所需的能量[2]。由于FDH催化的反应可以再生NADH，因此在工业生产中有着重要的应用价值。

目前，工业上应用的FDH可以通过构建高水平表达重组FDH蛋白的基因工程菌来生产[3，4]。检测重组蛋白的高效表达和积累，一般利用分子生物学的方法有SDS-PAGE、Western blotting和质谱等方法，这些方法操作繁杂，耗时耗力，样品需要染色标记，甚至破碎细胞。单细胞光镊拉曼光谱技术（LTRS）的应用，使得溶液中单个活细胞的生理生化变化过程的研究成为可能[5]。由于生物大分子，如核酸、蛋白、脂类和糖类等，都具有特异的拉曼光谱。从这些特征的光谱中可以获取细胞生物大分子的组成、结构及生理状态等重要信息[6，7]。Chan等[8]首次应用LTRS研究用异丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl thiogalactoside， IPTG）诱导单个重组大肠杆菌细胞表达髓鞘少突胶质细胞重组糖蛋白（Myelin oligodendrocyte glycoprotein， MOG），结果显示， 蛋白质的拉曼特征峰1257， 1340， 1453， 和1660 cm

䥺Symbolm@@ 1的峰强随着IPTG诱导时间的延长而增加，这种变化主要是IPTG诱导MOG的过量表达所致。Xie等[9]利用单细胞激光拉曼光谱（LTRS）成功快速地检测出斑马鱼β生长乳素重组蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母细胞中的表达，通过LTRS发现活体单细胞内重组蛋白的表达量随着时间延长而增多，且在细胞内累积，并对该重组蛋白表达进行定量分析。与传统的SDS-PAGE相比，LTRS单细胞技术检测重组细菌重组蛋白的表达，不需要破碎细胞，也不需要染色标记，样品制备过程简单，样品需要量少，可以在单细胞水平上研究活体细胞重组蛋白的表达，具有非破坏性和检测速度快的特点。本研究利用已经构建好重组质粒pET28a-fdh转化大肠杆菌Escherichia coli Rosetta，应用LTRS研究 IPTG诱导单个大肠杆菌活体细胞中重组蛋白FDH的实时表达，为分析基因工程菌中FDH的表达提供一种简单快速，且不需要破坏细菌细胞的方法。2 实验部分