紫外辐射诱导牡蛎细胞DNA损伤的 单细胞凝胶电泳检测

摘要: 以牡蛎为研究对象，建立了水产动物DNA损伤的单细胞凝胶电泳检测方法.分别以20W紫外灯距离30cm照射牡蛎血液细胞30、60和120s，然后用单细胞凝胶电泳技术检测细胞DNA的损伤.结果表明：未照射的细胞未受损伤，在电场中核DNA几乎不泳动，染色后呈圆形的荧光团，无拖尾现象.紫外照射后细胞核DNA均不同程度受损，且拖尾率、尾长、尾矩、Olive尾矩等指标值均随着照射时间加长而增加，DNA损伤程度与紫外照射时间之间存在明显的时间效应关系.研究结果为我国海洋环境中辐射防护研究和辐射毒理学检测提供新的研究方法和思路.

关键词: 单细胞凝胶电泳;彗星实验;紫外辐射;DNA损伤;牡蛎

中图分类号:Q952.6

文献标识码:A文章编号:1672-8513(2010)06-0400-04

UV Radiation-Induced DNA Damage in Oyster Cells Measured by Single Cell Gel Electrophoresis

XIONG Hejian1,MA Ying2,WANG Lin2,TANG Senming3

(1.College of Bioengineering, Jimei University，Xiamen 361021, China；2.College of Fisheries, Jimei University，Xiamen 361021, China；3.The Third Institute of Oceanography SOA， Xiamen 361021, China)

Abstract: In order to detect DNA damage induced by radiation in marine environments, the single cell gel electrophoresis (SCGE) technique for detecting DNA damage of aquatic animals was established. Oyster cells were exposed to a 200W ultraviolet (UV) lamp at a distance of 30cm for different times (0s, 30s, 60s and 120s), and the damage was measured by SCGE. The results showed that DNAs in the control group are free of damage, static in the electric field and appeared as a round fluorophore without any cometic tails. While those radiated DNAs are damaged to various degrees, and the four indices (Tail length, %DNA in tail, Tail moment, Olive tail moment and Tailing percent) used for assessing the damage increased with the radiation times. There existed a timeeffect relationship between SCGE indices and UV radiation time. The results will provide new methods and clues in toxicology testing for radiation pollution in marine environments.

Key words: single cell gel electrophoresis; comet assay; UV radiation; DNA damage; oyster

随着工农业的迅猛发展和人类活动的不断增加，环境污染日趋严重。环境污染对生物的影响已经成为人们关心的环境问题之一.研究发现，环境中某些物理（电离辐射等）和化学（重金属、农药、化学试剂等）因素会直接或间接作用于生物体DNA，干扰或破坏DNA的复制过程，引起DN断移位、易位和丢失等，进而引起动物的遗传损伤并影响其遗传行为［1］.

单细胞凝胶电泳（Single Cell Gel Eletrophoresis，SCGE），又称彗星试验，最早于1984 年由Ostling和Johanson报道［2］，它可根据电泳后DNA的拖尾长度定量检测真核细胞中DNA的损伤程度.由于SCGE具有简便、快速、样品用量少、无需放射性标记和对环境污染物、致癌剂的检测谱宽，灵敏性高等优点［3］，其应用日益广泛.目前，SCGE 技术已广泛应用于检测哺乳动物（主要是人、小鼠）肝、脾、骨髓等体细胞、生殖细胞细胞、尤其是淋巴细胞的DNA损伤研究［4-6］，[JP3]对植物细胞DNA损伤的研究也有报道［7-9］，但在水产养殖动物的研究方面报道较少，现有的研究主要是用SCGE检测重金属对河蟹［10］、鲫鱼［11］和中华绒螯蟹［12］，以及壬基酚对扇贝［13］细胞DNA的损伤.

随着沿海核能应用和开发的不断增长，海洋环境的放射性污染风险增大，加强海洋生物的辐射效应研究、保护海洋生物群落的健康是和平利用核能和保护人类健康的前提［14］.牡蛎是最重要的海洋经济种类之一，牡蛎养殖的总产量和单位面积产量在所有海产贝类养殖品种中位居首位［15］，在海洋生物中具有一定的代表性.牡蛎也是国内外生物检测首选的指标种.本研究以紫外辐射为DNA损伤诱导物，用单细胞凝胶电泳技术检测牡蛎细胞DNA的受损情况，为我国海洋环境辐射防护研究和毒理学检测等提供新的研究方法和基础数据，为我国核电建设、环境安全、食品安全和管理决策提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

常熔点琼脂糖（NMA）和低熔点琼脂糖（LMP）为Promega公司产品；二甲基亚砜（DMSO）、十二烷基肌氨酸钠、溴化乙锭（EB）均为Sigma公司产品；TritionX-100为Amresco分装；Tris、乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）等购自上海生物工程公司；台盼蓝试剂购自厦门鹭隆生物科技发展有限公司；其它药品为国产分析纯试剂.

单面磨砂载玻片购自厦门绿茵试剂玻仪有限公司.SZX-J型超净工作台为上海浦东荣华科学仪器有限公司产品，紫外消毒灯(20W、220V、50Hz)发射的UV-C波段光源(254nm)；EPS300型Tanon电泳仪购自上海天能科技有限公司；水平电泳槽为北京市六一仪器厂产品；Leica DMLA型荧光显微镜及照相系统为德国Leica公司产品.

1.2 试验材料

试验用近江牡蛎于2009年4月购自厦门市集美区农贸市场，壳长（12.6±0.6）cm，高（4.8±0.4）cm.

1.3 单细胞凝胶电泳

在Singh等［16］的方法基础上稍做改进，具体步骤如下：

1）制胶：将110μL 1%的常熔点琼脂糖（NMA）浇注于磨砂载玻片上涂抹均匀作为底层，盖上盖玻片，于4℃冰箱进行固化；取鲜活牡蛎，解剖并迅速刺破闭壳肌，待血液流出后用移液枪抽取，置离心管中离心2min(4000r/m)后弃上清，获得的血细胞用PBS缓冲液调节细胞浓度为1.4×107个/mL，用台盼蓝染色检测细胞活性.细胞悬液与50℃左右0.8%的低熔点琼脂糖（LMP）按1∶3的比例混合备用；第1层胶凝固后，取下盖玻片，吸取110μL上述细胞混合液浇注第2层，盖上盖玻片置于4℃冰箱固化20min.

2）染毒：取下盖玻片，置于超净台20W紫外灯下距离30cm照射30、60和120s，进行染毒，每个重复处理3次，以未染毒的玻片为对照.

3）裂解、电泳：载玻片用蒸馏水冲洗2~3次后放入预冷的细胞裂解液(2.5mol/L NaCl，0.1mol/L EDTA，0.01mol/L Tris，1% 肌氨酸钠，pH 10，1% TritionX-100，10% 二甲亚砜)中，4℃冰箱避光裂解3h.裂解完毕用蒸馏水冲洗玻片，将玻片水平放于电泳槽，倒入新配制的碱性电泳缓冲液(0.3mol/L NaOH，1mmol/L EDTA，pH>13)，使液面略高于凝胶玻片，避光解旋20min后电泳约20min.电泳条件，4℃，稳流300mA.电泳结束后轻轻移出玻片，用Tris-HCL浸泡2次，每次10min以中和碱.

4）染色、观察及数据分析：每片滴加50μL，20μg/mL溴化乙锭(EB)，避光染色约15min.样品于激发波长为515~560nm 的荧光显微镜下观察.先在荧光显微镜低倍镜下观察DNA损伤，然后在高倍镜下，每个处理用图像采集系统采集30个细胞进行拍照和数据分析.

1.4 彗星图像的分析

用TriTck CometScoreTM软件［17］进行分析，计算出彗星拖尾长度、尾部DNA的相对含量（尾部DNA占总DNA的百分比）、尾矩（尾长与尾部DNA相对含量的乘积）、Olive尾矩（从头部密度重心到尾部密度重心的距离与尾部DNA相对含量的乘积）等参数，用于评价DNA的损伤程度.同时统计各处里中细胞DNA的拖尾率（有拖尾的细胞个数占所统计细胞总数的百分比）.

图1 紫外线不同照射时间诱导的牡蛎血液细胞 DNA损伤的单细胞凝胶电泳彗星图像

1.5 数据处理

应用 SPSS 16.0 软件处理.

2 结果

台盼蓝染色观察表明，细胞存活率大于90％.图1是用紫外线进行不同时间（30、60、120s）照射处理后的单细胞凝胶电泳图，以未照射细胞为对照.可以看出，未受损细胞及紫外线不同照射时间损伤的细胞DNA表现明显不同.未经照射的细胞核DNA结构紧密，在电场中几乎不泳动，染色后呈现圆形的荧光团,无拖尾现象；而受损DNA在电场力的作用下,单链断裂的碎片离开核DNA向阳极迁移, 表现为荧光团较大或形成拖尾.随着照射时间的加长，细胞核DNA受损越严重,产生的断链或碱变性片段就越多,片段也越小,电泳表现为尾长增加和尾部荧光增强.紫外照射120s后可以看出细胞核DNA头部轮廓不明显，呈弥散状态.

表1是每个处理随机选取30个细胞用TriTck CometScoreTM软件进行分析的结果.从表1可以看出各分析指标与紫外照射时间之间存在较好的相关性，随紫外照射时间的加长各指标值增加，表现出良好的时间效应关系.对照组受损细胞极少，DNA拖尾率仅6.0％，其它指标值接近0，说明细胞没有发生DNA断裂；紫外照射30s后各分析指标值迅速增加，细胞DNA拖尾率达80％以上，说明牡蛎细胞对紫外辐射很敏感.随着照射时间由30s增加到60、120s，各指标值均显著增加.照射时间由60s增加到120s时，DNA拖尾率、彗星尾长等指标的增加幅度趋于平缓.

3 讨论

单细胞凝胶电泳中染毒处理使得细胞核逐渐失去原有的紧密结构，变得疏松，直径变大.增加染毒时间或浓度可以提高彗星试验检测的敏感性，但研究表明彗星试验也有检测阈值［18］，当细胞损伤超过一定此值后，该方法就不能够进行准确检测.且染毒时间过长或浓度过高，DNA迁移距离过大，彗星图像会失去明显的头部，尾部弥散范围较大，会增加结果统计的困难.所以，应选择合适的染毒时间或浓度.本研究经过一系列的预实验，最终选定用20W紫外灯距离30cm照射30～120s的实验条件.

经典的制胶方法是在载玻片上制备“三明治”型胶体.第1层和第3层为常熔点琼脂糖，第2层是含细胞的低熔点琼脂糖.其中第1层胶可使第2层胶与载玻片黏附更加牢固.第3层胶可以防止含细胞胶层的盐分向电泳缓冲液的扩散［19］，但三层胶的制作时间较长，且可能不利于染色和荧光显微镜下的观察.本实验用二层胶代替经典的三层胶，在裂解后增加了水洗的步骤，以除去胶体中各种影响电泳的粒子，也得到了较理想的实验结果.在样本数量多的情况下，与“三明治”型胶体相比，二层胶的方式具有操作简便、节省时间、易于检测等优点.

紫外线作为强的能量辐射,使细胞内无铁卟啉产生单线氧,从而活化而生成氧自由基,自由基的作用使DNA氧化而损伤,诱导细胞恶变.紫外线诱导氧自由基产生氧化损失是导致基底细胞癌、皮肤癌等上皮细胞癌的主要原因之一.我们用单细胞凝胶电泳检测紫外诱导的牡蛎细胞DNA损伤，用DNA拖尾率、尾长、尾矩、Olive尾矩等作为分析指标，结果表明，20W的紫外灯照射30s即可造成明显的DNA损伤，且随着紫外照射时间的延长，DNA损伤率及损伤程度相应增加，与尾长、尾部DNA相对含量、尾矩和Olive尾矩等指标之间表现出良好的时间效应关系，说明用彗星实验检测牡蛎细胞辐射损伤方法可行，且上述分析指标能较客观地反映DNA的受损伤程度.前人的研究结果也表明，在一定的辐射剂量范围内，以TDNA％、TL、TM和OTM为指标的分析结果较为可靠［20］.

彗星实验是一种快速、简单、直接的DNA损伤检测手段，在环境污染物检测、辐射防护、辐射生物剂量学等研究领域有广阔的应用前景.本文以牡蛎离体细胞为研究对象，建立了水产动物彗星实验检测方法.后续研究应进行活体辐射的彗星实验研究，为自然环境中辐射等污染物的毒理学检测等奠定基础，进而为近海海域的管理决策提供科学依据.

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