p53基因与胃癌的关系

樊毓综述 于燕妮审校

【关键词】 胃癌；p53基因；突变；基因治疗

胃癌的发生发展是多基因参与、多步骤进行的过程，而p53基因突变作为一种重要抑癌基因失活方式，在其中发挥了重要作用。本文介绍了p53基因的结构和功能，并对胃癌中发现的p53基因突变类型、方式、与多种因素之间的关系以及针对p53进行肿瘤基因治疗等方面研究进展进行简要综述。

肿瘤的发生演变是多阶段和多基因参与的极为复杂的过程，原癌基因的激活和抑癌基因的失活与肿瘤的发生发展密切相关，p53基因的缺失或失活与50％人类肿瘤的发生发展相关[1]。研究发现，难治的肿瘤p53基因突变率较高，而相对容易治疗的肿瘤较少发生p53基因突变。因此p53基因的抑癌作用倍受研究者的关注，近年来一直为医学生物学研究的中心课题之一，并冠以"明星分子"的称谓。医学科技工作者期望从p53基因的研究中进一步探求癌症发生机理，寻找一条有效的抑癌途径。在短短的20多年里，对p53基因的认识经历了癌蛋白抗原，癌基因到抑癌基因的三个认识转变。

1 p53基因结构及生物学功能

1．1 p53基因的结构 人类p53基因定位于染色体17号染色体短臂(17q13．1)，约20 Kb长，由11个外显子和10个内含子组成，其中第1个外显子不编码，其上游400 bp处有启动子p1，下游1 kb处有启动子p2，二者为转录起始点。正常的p53基因又称野生型p53基因(wt－p53)，其功能的改变或缺失与大量不同种类的人类肿瘤细胞有密切关系，同时还被认为是细胞应激的关键性调控分子之一，能整合各种不同的细胞危急事件的信号，通过转录或非转录途径对这些信号做出包括细胞生长抑制或凋亡在内的不同反应[2]，监视细胞基因组的完整性。

p53编码的蛋白质是由393个氨基酸组成的、与细胞分裂周期相关的蛋白质，分子量53 KD，称为p53蛋白。p53蛋白是一种半衰期短的核内磷酸化蛋白，含有3个主要功能区[3]：①N端酸性转录激活区，含转录激活域(1～70)和含5个PXXP重复序列的富脯氨酸(60～97)。p53作为转录因子的转录激活功能依赖于转录激活域。PXXP重复序列区为SH3结合域，，参与信号传导，p53的某些非转录激活依赖与此有关[2]。PXXP重复序列的缺失还可使野生型p53的转录激活功能减弱，从而使其诱导细胞生长抑制和凋亡的功能下降。②序列特异性结合区(中央保守区)，即是p53与DNA相结合的区域，p53与DNA序列特异性地结合是p53行使抑癌功能的中心环节。p53蛋白有5个进化高度保守区，其中4个(Ill～V)位于中央保守区内,并且是肿瘤细胞最常发生突变的区域，含有6个突变热点，占已知p53错义突变的40％。③C端既是独立的功能区域，是一段能控制p53与特异序列DNA结合的调控区域。p53蛋白的C端存在一个四聚化功能域，由β片层和α螺旋共同形成二聚体，完整的四聚体即是该二聚体的二聚体[4]，四聚体是p53与DNA结合效率最高的形式，许多p53下游基因的表达依赖于野生型p53的四聚化。C端被磷酸化、与抗体或短片段的单链DNA结合以及缺失等，可以使p53DNA结合区域与DNA的结合大为增强。由于C端的共价和非共价修饰均可激活p53特异结合DNA，因此，未经修饰的C端被认为是中央DNA结合域的负调控因子[5]。

1．2 p53抑癌作用 p53抑癌作用的产生依赖于其健全的生物学功能的表达，主要从以下方面得以实现：①参与细胞周期调节、促成损伤修复。野生型p53的抗肿瘤作用主要是阻滞G/G0期，使细胞不能进入S期，从而抑制细胞的增生。在所有使细胞内p53水平或活性升高的因素中，DNA损伤是最为常见和迄今研究得最深入的一个因素。p21WAF1/CIP1基因编码产物是一种细胞周期素依赖性蛋白激酶(CDK)，通过调控细胞周期的进程，参与细胞的生长、分化、衰老及死亡。在p21编码区上游2．4 kb和大于8 kb处有2个p53结合区，在上游75 bp处有一个弱p53结合区,DNA损伤后野生型p53(wtp53)激活诱导p21WAF1/CIP1表达产生p21蛋白，并使p21与细胞周期素D竞争性结合CDK中的CDK4，抑制CDK4的功能，使PRB无法磷酸化。同时p53转导激活GADD45基因的表达产物，其与p21协同抑制增殖细胞核抗原(PCNA)的活性，阻碍DNA聚合酶－δ(pol-δ)的激活，细胞阻滞于G1期，在细胞进入S期前修复损伤的DNA[6]。②诱导细胞凋亡。凋亡被认为是某些类型的细胞对DNA损伤做出的应激反应，并且该过程依赖于野生型p53的存在[5]。将外源性p53基因导入某些肿瘤细胞中能够激活细胞凋亡过程的事实，更突出表明了P53在DNA受损诱导凋亡过程中的重要作用。p53抑制凋亡抑制蛋白(IAP)家族中的生存蛋白(survivin)表达，阻碍其促癌作用[7]。Mirza等研究表明p53活性影响着survivin基因的表达[8]。同时p53通过其自身抑制端粒酶的基因位点3q、8q和DP对端粒酶特别是端粒酶反转录酶(TERT)进行调节，而使异常染色体遭受融合、降解，p53在无法正常修复时能自动降低细胞凋亡阈值，使凋亡更易发生[9]。③抑制肿瘤细胞的分化、转移。野生型p53基因在癌症发生过程中通过多种机制对肿瘤细胞分化、转移、恶化进行抑制。常见的是抑制环氧化酶(COX-2)的表达而发挥强有力的抑癌作用[10]。环氧化酶(COX)是催化前列腺素合成的限速酶，有在多种正常组织中恒定表达的原生性COX-l和在炎症组织中表达增强的诱生性COX-2，二者的氨基酸序列有60％以上同源性。COX-1在大多数哺乳动物组织呈常规表达，执行"看家"功能，而COX-2则呈诱导性表达： COX-2过度表达能促进肿瘤血管生成，从而促进肿瘤的生长及血道转移[11]，并能抑制细胞凋亡。体外试验显示[12]，野生型p53可抑制TATA结合蛋白结合至COX－2的启动子区域，从而使无p53突变者的前列腺素2表达水平低于突变者的10倍左右。④抑制肿瘤血管生成而阻断其营养来源。医学界已经公认p53基因对肿瘤血管的形成产生影响。血管形成过程受到大量促血管生长因子和抗血管生长因子的调节，其中血管内皮生长因子(VEGF)调节血管形成的作用最强，其作用的发挥需要通过与细胞膜上的相应受体(VEGFR)的相互结合。有学者用阳离子脂质体DNA复合物将p53经静脉导入抑制肿瘤血管生成，并发现野生型p53通过特异地诱导产生血小板反应素-1(TSP-1)发挥了抗血管形成作用。Mukhopadhyay[13]试验表明野生型p53抑制N-87MG细胞株的血管内皮生长因子(VEGF)启动子活性，下调VEGFmRNA水平。有研究显示[14]p53表达阳性的胃癌组织其VEGF的阳性率为66．7％，明显高于p53表达阴性的胃癌组织，显示P53突变可上调VEGF的表达，促进其合成，并进一步促进肿瘤的微血管生成。⑤p53基因可以抑制多重耐药基因(MDR)的转录，为抑癌创建更积极的治疗平台。多种肿瘤的耐药细胞中有多重耐药基因的表达增高，p53、ras等癌基因也参与调控MDR基因的表达，它能促进MDR启动子的转录，调控MDR基因表达，使肿瘤产生耐药[15]。蛋白水平研究，当p53基因发生缺失、突变等表达异常时，一方面p53对凋亡过程的调控发生异常，细胞凋亡受到抑制，另一方面p53突卞蛋白积聚促进了MDR基因表达而产生较高水平的耐药糖蛋白Pg蛋白，从而使肿瘤细胞获得MDS表型，最终导致肿瘤细胞对化疗药物的耐药性显著增强[17，18]。

2 p53基域突变及与胃癌的关系

p53基因自身的结构改变是p53基因抑癌功能丧失的主要机制。据统计，肿瘤中p53蛋白393个氨基酸中有280个以上曾发生了突变，包括转换、颠换、插入、缺失，大多数属于单碱基置换(点突变)，导致p53蛋白的一个氨基酸发生改变(错义突变)，少数导致翻译终止(无义突变)。p53基因点突变主要发生在进化过程中较保守的4个密码子及第5～8外显子，分别编码132－143、174－179、236－248和272－281号氨基酸[19]。

p53基因或其蛋白产物表达异常，主要是mdmT2癌基因的负调节。激活态的p53蛋白与mdm2基因的两个串列成分结合，激活mdm2转录与表达。同时mdm2蛋白分子中存在p53蛋白的结合部位，当两蛋白形成复合物时，p53蛋白被灭活，稳定性增高造成过表达。如此野生型p53和mdm2之间形成了一个负反馈调节环，维持野生型p53的正常生理功能 [20-22]。肿瘤组织中mdm2主要表现为基因扩增和过表达，从而导致野生型p53的抑癌活性丧失。Gunther[23]的研究则认为mdm2基因扩增与胃癌扩散有关，同时证实mdm2／p53途径与胃癌发生密切相关。国内孙利平[24]的研究证实mdm2基因扩增是胃癌发生的重要原因，并且与肿瘤的分化程度密切相关。

p53蛋白具有与双链DNA和单链DNA结合能力，同时能与某些肿瘤病毒转化蛋白结合而致功能改变，通过干扰p53的转录激活活性与诱导细胞凋亡作用、加速p53的降解、阻断p53向胞核穿梭而使p53失活。目前已报道的能与p53结合的细胞内蛋白有CBF、E6-AP、ERCC3、HSP70、mdm2、RPA、SP1、TAFⅡ40、TAFⅡ60、TBP和WT1等；能与p53结合的DNA肿瘤病毒蛋白有腺病毒E1B、EBNA5、HPV-E6、SV40T和HBvAg。

根据国际癌症研究机构TP53突变数据库数据统计，共收录发生在胃部的750例p53基因突变，主要是点突变。突变率最高的为exon5(32．53％)。研究认为[25]胃癌中p53基因突变以C-A和A-C突变为主(66．7％)，G-T、T-G突变率占15．5％。在已有的研究中，超过60％的胃癌表现p53基因的突变和17p上p53位点的杂合性丢失[26]。Kobayashi[27]的研究结果显示胃癌中p53基因功能丧失或降低，可能的原因就是I7p13．I的缺失和保留的p53等位基因的错义突变，提示17p的缺失对p53基因的等位基因的缺失起着重要的作用。Sano[28]等研究认为胃癌中l7p染色体的等位基因丢失频繁：分化好的腺癌，在癌症早期为67％丢

失；在癌症进展期73％丢失；在低分化的腺癌中有60％杂合性丢失。

3 p53基因在基因治疗中的应用

近一个世纪以来，外科手术、化疗和放疗一直是人类治疗恶性肿瘤的主要方法，随着分子生物学的不断发展，对于疾病的病因、发生、发展的研究已深入到分子水平。因此，基因治疗正逐渐从理论成为现实，它具有选择性强，不良反应小，对晚期肿瘤及转移灶仍有效等优点，成为继手术、放疗、化疗后的又一种治疗方法。1980年Cline将小鼠细胞DNA转录至骨髓细胞，然后将转录的骨髓细胞移植给经全身照射后的小鼠，使转录基因得到了表达，成为基因治疗的先导，人类对肿瘤的治疗揭开了新的一页。目前，临床前试验研究已取得肯定的结果，如导入野生型p53基因能抑制人类多种实体肿瘤的恶性表型。

肿瘤基因治疗的原理是将目的基因用基因转移技术导入靶细胞，使其表达此基因而获得特定的功能，继而执行或介导对肿瘤的杀伤和抑制作用，从而达到治疗之目的。目前研究最多的是以正常的野生型p53基因替换肿瘤细胞中突变的p53基因，称为野生型p53基因的替代疗法，其关键是如何将外源性p53基因导入肿瘤细胞并获得安全有效的表达。常用的方法有DEAE－葡聚糖法，磷酸钙法，阳离子脂质体法，病毒介导法（包括腺病毒介导和逆转录病毒介导）等。而现阶段国内外学者研究最多，发展最快的是以腺病毒和脂质体为载体导入正常野生型p53基因的替代疗法。

腺病毒是一种DNA双链无包膜病毒，具有广泛的宿主感染性，提高了靶细胞的感染率；同时作为载体，其DNA不整合到宿主细胞染色体中，安全性较高，能避免治疗引起的基因突变和癌基因的激活，可以通过多种方式给药。研究表明重组人腺病毒具有独立的抑制多种肿瘤生长的作用，还可以通过激活bax基因、抑制bcl-x基因以及诱导前凋亡基因puma、bak、fas的表达，促进细胞凋亡，提高多种肿瘤细胞对化、放疗的敏感性。大量研究证明，通过重组人p53腺病毒感染的方法，可以重建肿瘤细胞内变异的p53基因，使肿瘤细胞的化疗敏感性明显提高[29]。国内学者已通过腺病毒介导野生型p53基因改变胃癌细胞内在的p53状态，提高对放疗与热疗的敏感性[30]。大量的研究表明，腺病毒介导的p53基因感染肿瘤细胞后，能有效地控制肿瘤细胞生长或引起凋亡。目前，运用腺病毒介导的p53基因治疗食管癌、非小细胞肺癌、肝癌已进入II期临床试验。2004年我国率先将世界上第一种基因治疗药物重组人p53腺病毒注射液(rAdp53 injection)应用于头颈部肿瘤患者的临床治疗。

但是腺病毒抗原性较强，体内应用高滴度腺病毒重组体会经起对转导细胞免疫排斥及炎性反应等。鉴于腺病毒载体在治疗过程中存在的缺点，研究者们对脂质体进行了较为深入的研究。脂质体是1965年英国学者Bangham等将磷脂分子散在水中进行电镜观察时发现并命名的。1972年，Gregoriadis和Rymam将脂质体用于药物载体。传统的脂质体载体在体外转染的效率较低，因此现有的研究旨在努力提高其基因治疗的转染效率和提高其针对肿瘤细胞的靶向性。有学者用亲水的多聚分子聚乙二醇(PEG)修饰脂质体，提高循环中外源基因的浓度、降低脂质体复合物在体内的毒性。但是也有学者发现脂质体PEG化后可以阻止脂质体与靶细胞的结合，阻止DNA从脂质体内部释放，降低其基因转染效率。张锦瑜等[31]构建了包含野生型p53基因全长cDNA的真核表达载体pcDNA3－p53，用脂质体介导法将其转染人未分化胃癌细胞系HGC27中，发现野生型p53基因通过诱导细胞凋亡对人胃癌HGC27细胞增殖产生抑制作用。国外研究已证实在神经系统的肿瘤中采用转染野生型p53质粒方法，使肿瘤细胞发生凋亡，从而达到治疗肿瘤目的Hofland等[32]研究用叶酸盐受体来修饰脂质体，发现其可以减少脂质体在肺部的积聚并大大提高了转染效率。Dunphy等联合腺病毒和脂质体两种转基因载体的方法，观察在基因表达上是否有协同性，结果证实在腺病毒转染中加入脂质体DNA复合物能增强腺病毒介导的基因表达；联合脂质体转染和腺病毒转导能延长转基因表达的时间，并且与单独脂质体转染相比，毒性没有增加。

总之，p53基因作为一个重要的肿瘤抑制基因，在肿瘤细胞的发生、发展中都具有重要作用，具有良好的应用前景，针对p53基因的肿瘤的基因治疗已从体外细胞培养过渡到动物模型阶段，部分已进入Ⅱ期临床试验阶段。但目前所进行的工作还处于探索阶段，需要更深入地研究其作用机制，进一步了解其与多种肿瘤的相关性，寻找更有效的载体，提高转染效率，研究其与化疗、放疗及免疫治疗的相互关系以及与其他基因治疗的协同作用，使p53基因治疗成为肿瘤治疗的又一种有希望的治疗方法。

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