青蒿琥酯抑制肝星状细胞microRNA―154/ β―catenin治疗肝纤维化的机制研究

[摘要] 目的 探讨青蒿琥酯抑制肝星状细胞microRNA-154/β-catenin治疗肝纤维化的机制。 方法 培养大鼠肝星状细胞，用不同浓度（0、5、10、20、30、40 μg/mL）青蒿琥酯作用于大鼠肝星状细胞，采用免疫印迹法（Western blot）检测青蒿琥酯作用后细胞内β-catenin蛋白的表达；实时定量RT-PCR检测青蒿琥酯作用后细胞内的miR-154和β-catenin mRNA的相对表达。 结果 0～40 μg/mL青蒿琥酯作用细胞24 h后，免疫印迹法结果显示，β-catenin蛋白量逐渐降低，并呈剂量相关性（P < 0.05）；实时荧光定量PCR结果显示青蒿琥酯作用后，β-catenin mRNA表达量及miR-154表达量逐渐降低，并呈剂量相关性（P < 0.05）。 结论 青蒿琥酯可能是通过抑制microRNA-154表达作用于Wnt/β-catenin信号通路及来抑制肝纤维化的发生，microRNA-154与Wnt/β-catenin信号通路可能存在一定的相关性。

[关键词] 青蒿琥酯；肝星状细胞；miR-154；Wnt/β-catenin信号通路；肝纤维化

[中图分类号] R914.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）01（a）-0035-04

Mechanism research on Artesunate in the treatment of liver fibrosis by inhibiting miR-154/β-catenin in hepatic stellate cell

ZHANG Ying ZHANG Hong PENG Rui WEI Danyun

Department of Pharmacy， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To investigate the mechanism of Artesunate in the treatment of liver fibrosis by inhibiting miR-154/β-catenin in hepatic stellate cell. Methods HSC-T6 cells were cultured in vitro with different concentrations （0， 5， 10， 20， 30， 40 μg/mL） of Artesunate on rat hepatic stellate cells. Western blot was used to detect the expression of β-catenin protein after drug administration. RT-PCR was used to detect the expression of β-catenin mRNA and microRNA-154 after drug administration. Results After treatment with artesunate for 24 h， the results of Western blot showed that the expression of β-catenin protein significantly decreased in a dose-dependent manner （P < 0.05）. The results of RT-PCR showed that the expression of β-catenin mRNA and microRNA significantly decreased in a dose-dependent manner （P < 0.05）. Conclusion Artesunate may suppress the occurrence of liver fibrosis through inhibiting the expression of microRNA-154 on Wnt/β-catenin signaling pathway. There may exist a certain correlation between miR-154 and the wnt/β-catenin signaling pathway.

[Key words] Artesunate； Hepatic stellate cell； miR-154； Wnt/β-catenin signaling pathway； Liver fibrosis

肝纤维化是所有慢性肝病发展成肝硬化的共同病理基础与必经途径，是“慢性肝炎-肝纤维化-肝癌”的中心环节，并且具有可逆性[1-2]。肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化是导致肝纤维化发生的主要发病机制，肝损伤后导致HSC大量活化增殖，从而合成分泌大量的细胞外基质（extracellular matrix，ECM），ECM的大量沉积导致肝纤维化的发生[3]。因此促进活化的HSC凋亡可能成为治疗肝纤维化的有效方法。

Wnt/β-catenin信号通路是促肝纤维化细胞凋亡的主要转导通路之一，通路活化后，β-catenin移位至细胞核，与核内T细胞因子/淋巴增强因子（TCF/LEF）结合诱导靶基因转录，促进肝纤维化的发生[4-5]。micoRNA（miRNA）是一类细胞内源性小片段 RNA分子，由20～25个核苷酸组成[6]。可以在转录后水平通过调控靶基因的表达而影响细胞的增殖、分化、凋亡及个体的生长发育等生命过程[7-8]。近年来研究发现，miRNA参与了多种疾病的病理过程，是重要的疾病候选诊断标志物及潜在治疗靶点[9]。本课题组发现miR-154在大鼠HSC中表达具有较大程度的上调，抑制miR-154的表达可有效地促进细胞凋亡。

青蒿琥酯（Artesunate）是青蒿素的衍生物，前期研究发现青蒿琥酯可以促进肝星状细胞的凋亡[10]，本实验深入探讨了青蒿琥酯作用后HSC中Wnt/β-catenin信号通路中的蛋白表达含量及microRNA-154的表达量变化，研究两者在促进HSC凋亡过程中的相关性。为探讨青蒿琥酯抗肝纤维化的作用机制提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 大鼠HSC（HSC-T6）购于上海艾研生物有限公司，由美国ATCC细胞库引进，为SV40转染的大鼠肝星状细胞，其表现型为活化的HSC细胞。

1.1.2 试药 注射用青蒿琥酯（桂林南药股份有限公司）；RPMI-1640培养基（上海吉诺公司）；胎牛血清（美国Gibico公司）；胰蛋白-EDTA消化液（美国Gibico公司）；DMSO（美国Sigma公司）；96、6孔板（美国Corning公司）；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒（武汉谷歌生物有限公司）；β-catenin一抗（美国Cell Signaling Technology公司）；二抗羊抗兔IgG（美国LI-COR Biosciences公司）；RNA提取试剂Trizol（美国Invitrogen公司）； 逆转录试剂盒及RT-PCR试剂盒（日本TaKaRa公司）；引物由武汉巴菲尔生物技术服务有限公司设计并合成。

1.1.3 仪器 超净工作台（苏州集团安泰空气技术有限公司）；CB150 CO2细胞培养箱（德国Binder公司）；Heraeus Fresco 21低温微量离心机（德国Thermo公司）；Odyssey双色红外激光成像系统（美国LI-COR公司）；NanoDrop 2000c紫外分光光度计（美国Thermo Scientific公司）；普通 RT-PCR仪（东胜创新生物科技有限公司）；7500实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；荧光定量PCR管（美国ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 取大鼠HSC（HSC-T6）用RPMI-1640培养液（含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素）培养，于37℃、5% CO2饱和度的细胞培养箱内进行培养，待细胞生长密度大约为90%时，倒掉培养基，磷酸盐缓冲液（PBS）平衡盐溶液轻轻洗涤细胞2次，弃去PBS，用0.5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞，待细胞收缩变圆并开始滑落，立即加入培养基终止消化。轻轻吹打混悬细胞，1000 r/min 离心5 min，弃上清，用培养基将细胞吹散混悬，进行传代或种板。以3×105个细胞/孔将细胞接种于6孔板，待细胞生长密度至60%～70%时，分别换成用含5、10、20、30、40 μg/mL青蒿琥酯的培养基进行培养，并设一孔加等量不含药培养基作为对照组，培养24 h后，提取蛋白质和RNA。

1.2.2 细胞总RNA的提取 青蒿琥酯作用24 h后收集细胞，按照Trizol RNA提取试剂盒操作说明提取总RNA。加入1 mL Trizol反复吹打使细胞充分裂解，静置15 min，加入0.2 mL氯仿（Trizol∶氯仿=5∶1），剧烈振荡颠倒30 s，室温静置15 min。4℃，12 000 r/min离心15 min。移上清液至无酶离心管中，加入等体积异丙醇，静置10 min；4℃，12 000 r/min离心15 min，弃上清液，加1 mL 预冷的75%乙醇，洗涤RNA。4℃下7500 r/min离心10 min，重复1次。晾干至半透明，加入适量焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解RNA，紫外分光光度计测定浓度及纯度，于-80℃保存备用。

1.2.3 免疫印迹法（Western blot）测定青蒿琥酯作用后细胞内β-catenin蛋白表达变化 青蒿琥酯作用24 h后收集各孔细胞，PBS轻轻洗涤2次，加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定提取的蛋白浓度。加上样缓冲液，100℃加热煮沸7 min。每组取20 μg总蛋白上样，利用10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离各组细胞蛋白质，电转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。PVDF膜用5% BSA封闭液封闭1h，用封闭液稀释相应的一抗，一抗β-catenin兔抗鼠（1∶500）和GAPDH兔抗鼠4℃孵育过夜。TBST洗涤3次，加入羊抗兔二抗，室温摇床上慢速孵育1 h，TBST洗膜3次，利用Odyssey成像系统对PVDF膜进行扫描分析，检测各组细胞的β-catenin与GAPDH蛋白条带的灰度值，计算两者比值作为其相对蛋白表达量。

1.2.4 Real-time PCR测定青蒿琥酯作用后细胞内β-catenin mRNA及miR-154表达变化 取合格的RNA样品，采用逆转录试剂盒和荧光定量SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mixture 试剂盒检测β-catenin mRNA、miR-154在各组细胞中的表达情况。β-catenin mRNA以GAPDH为内参，miR-154以U6为反应内参，β-catenin、GAPDH、U6和miR-154的逆转录引物及RT-PCR反应引物由武汉巴菲尔生物技术服务有限公司设计并合成，引物序列见表1。RT-PCR反应条件为：95°C，30 s，1个循环；95°C，5 s，60°C，40 s，共40个循环；95°C，30 s，60°C，1 min，95°C，15 s。反应在96孔板中进行，每个反应设3个复孔，共包含20 μL的反应体系。反应结束后得到各组的目的基因和内参的Ct值，以内参进行标准化处理，使用 ΔΔCT 法分析RT-PCR 所得数据，根据公式2-ΔΔCT，（ΔCT=CT目的基因-CT内参，ΔΔCT=ΔCTArt组-ΔCT对照组），计算分别得到目的基因β-catenin和miR-154的相对表达量，并进行统计学分析并做图。

表1 RT-PCR中各引物序列

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，相对实时定量PCR测定结果和蛋白表达测定结果处理采用配对t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 青蒿琥酯对大鼠肝星状细胞内β-catenin蛋白表达水平的影响

与空白对照组比较，随着青蒿琥酯药物浓度的不断升高，肝星状细胞内β-catenin蛋白的表达量逐渐降低，并呈剂量依赖性，β-catenin蛋白的表达量与对照组之间的差异有统计学意义（P < 0.05），不同浓度组之间β-catenin蛋白的表达量差异有统计学意义（P < 0.05），表明青蒿琥酯作用于肝星状细胞可能与Wnt/β-catenin信号通路有关，结果见图1。

A B

注：A.B.不同浓度青蒿琥酯作用后β-catenin蛋白的表达量变化；与空白对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01

图1 青蒿琥酯对大鼠肝星状细胞β-catenin蛋白的影响

2.2 青蒿琥酯对肝星状细胞内β-catenin mRNA及miR-154表达水平的影响

与空白对照组比较，随着青蒿琥酯药物浓度的不断增加，肝星状细胞内β-catenin mRNA的表达量及miR-154的表达量逐渐降低，并呈剂量依赖性，β-catenin mRNA及miR-154的表达量与空白对照组比较差异有统计学意义（P < 0.05），不同浓度组之间的β-catenin mRNA及miR-154的表达差异有统计学意义（P < 0.05），结果见图2。说明青蒿琥酯抑制肝星状细胞的增殖可能与β-catenin及miR-154有关，miR-154与Wnt/β-catenin信号通路间可能存在一定相关性。

A B

与空白对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01

图2 青蒿琥酯对大鼠肝星状细胞β-catenin mRNA

及miR-154表达的影响

3 讨论

肝纤维化是指由各种致病因子所致的肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程[11]。许多慢性肝脏疾病均可引起肝纤维化，而肝纤维化是各种慢性疾病发展成肝硬化的中心环节，抑制肝纤维化的发生对预防肝硬化和肝癌的发生至关重要[12-13]。HSC是肝纤维化发生过程中的关键细胞，HSC被激活后大量增殖分化，在肝内表达过量的细胞外基质，最终引起肝纤维化的发生[14]。因此抑制HSC的活化增殖是治疗肝纤维化的有效方法。本实验前期用青蒿琥酯作用于大鼠HSC发现青蒿琥酯可以有效地促进HSC的凋亡[15]。

经典Wnt/β-catenin信号通路是近年来提出的促HSC凋亡的主要信号转导通路之一[16]。该通路未活化时，β-catenin呈磷酸化状态处于胞浆内，该通路活化后，β-catenin去磷酸化并移位至细胞核内，与T细胞因子/淋巴增强子因子结合，诱导Wnt调控的靶基因的转录，促进肝纤维化发生。有研究报道称抑制Wnt通路可以有效地促进HSC的凋亡，抑制肝纤维化的发生[17-18]。

近年来，microRNA被发现参与许多疾病的病理过程，是疾病潜在的治疗靶点和候选诊断标志物[19]。可以对基因的表达进行转录后调控，影响细胞的分化、增殖、凋亡以及个体生长发育等多种生命活动[20]。有研究发现miR-154在肺纤维化细胞中表达具有较大程度的上调，并且miR-154通过活化Wnt/β-catenin信号通路来促进肺纤维化细胞的增殖，促进肺纤维化的发生[21]。本研究前期发现，活化的大鼠HSC中miR-154较普通大鼠肝细胞也有较大程度的上调，同时Wnt/β-catenin信号通路在大鼠HSC中处于活化状态，说明miR-154和Wnt/β-catenin信号通路在肝纤维化的发生发展过程中也可能起着重要作用。本实验结果显示，青蒿琥酯作用HSC后，细胞内β-catenin蛋白含量及β-catenin mRNA表达量显著下调，同时miR-154的表达量也明显降低，并呈剂量依赖性，说明青蒿琥酯促进HSC的凋亡与Wnt/β-catenin信号通路及miR-154相关，可能是通过抑制miR-154对Wnt/β-catenin信号通路的调控而发挥作用，抑制miR-154可以抑制其对β-catenin的活化作用，下调β-catenin介导的基因转录，进而促进HSC的凋亡，抑制肝纤维化的发生。本研究结果提示miR-154及Wnt/β-catenin信号通路在青蒿琥酯抑制肝纤维化发生过程中的起着重要作用，但是miR-154与肝纤维化发生的关系、miR-154与β-catenin蛋白之间的关系及miR-154是否是通过对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用来参与肝纤维化还有待我们进一步研究。下一步我们将在大鼠HSC中转染miR-154模拟物及抑制物，观察其对大鼠HSC的增殖、凋亡的影响，观察其对Wnt/β-catenin信号通路中相关蛋白表达的影响，从而确定miR-154在大鼠肝纤维化发生过程中的关键作用，确定其可以作为治疗肝纤维化的潜在靶点。

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（收稿日期：2015-07-22 本文编辑：赵鲁枫）