核黄素在镀铂铅笔芯热电极上的电致化学发光检测

摘 要 利用电沉积方法制作了镀铂铅笔芯热电极（Pt/HPGE），用循环伏安法（CV）及扫描电镜（SEM）对其性质进行了表征。此电极具有价廉易得、重现性好及温度响应灵敏等特点。在此电极上研究了核黄素（RF）对Ru（bpy）32＋C2O42－电致化学发光体系的猝灭作用，并推测了可能的机理，据此建立了灵敏检测RF的新方法。电极温度升高到58℃时，检出限可达1.9×10－10 mol/L（S/N＝3），比室温时明显降低。应用于维生素药片中RF含量的测定，平均回收率为102.8%。

关键词 镀铂； 铅笔芯； 热电极； 核黄素； 电致化学发光

1 引 言

黄素是7,8二甲基异咯嗪的衍生物，根据异咯嗪环上N（10）位置所连基团的不同，主要分为核黄素（RF）、黄素腺嘌呤单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）[1]。作为动植物中广泛存在的黄素蛋白的辅基，RF参与了食物的吸收利用以及身体内能量的转化过程。如果人体缺乏RF，细胞生长将会明显受损，而且会出现一些眼部及皮肤方面的疾病。RF广泛存在于生物、药物及食物中[2]，因而对它的检测具有重要意义。传统的检测方法有荧光法[3]、毛细管电泳或高效液相色谱荧光检测法[4,5]、电化学方法[6]、化学发光法[7,8]等。电致化学发光法（ECL）结合了电化学和化学发光的特点，具有选择性好、快速灵敏、仪器简单便宜等优点［9］。利用ECL法测定RF的文献已有报道[10～12]。

热电极技术只对电极加热，因此具有能产生热对流而增强传质，促进电极反应等特点，已成功应用于电分析领域。Sun等详细研究了铅笔芯热电极（HPGE）的电极直径与升温性能的关系[13]，并在该电极上利用吸附溶出法测定了RF[14]。Lin等将热电极技术引入到ECL分析系统，通过研究电极表面温度对Ru（bpy）32＋[15]、光泽精[16]和鲁米诺[17] ECL行为的影响，发现升高电极表面温度能加快物质的扩散速度、降低电极表面的污染、提高发光信号的重现性。

铅笔芯热电极（HPGE）具有升温性能良好、电势窗口宽和易于进行表面修饰等特点，但是由于电极结构的多孔性，表面吸附性较强。Pt丝热电极表面不易吸附，但是电极制作技术要求较高，而且价格相对昂贵。本研究结合了HPGE和Pt热电极的优点，制备了镀铂铅笔芯热电极（Pt/HPGE），在此电极上研究了温度对Ru（bpy）32＋C2O42－ ECL体系的影响。利用核黄素对Ru（bpy）32＋C2O42－ ECL体系的猝灭作用，实现了对RF的灵敏检测， 并成功应用于实际维生素片中RF的定量检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

超微弱化学发光检测仪 （中科院生物物理研究所）；CHI 440电化学工作站（上海辰华仪器公司）。Ru（bpy）3Cl2•6H2O （St. Louis, MO, USA），以水配成4×10－3 mol/L溶液，于4 ℃保存备用；核黄素（AR，国药集团化学试剂有限公司），以0.10 mol/L醋酸溶液配成2.657×10－4 mol/L储备液，4 ℃避光保存备用，使用时用0.1 mol/L KCl稀释至所需浓度。其它试剂均为国产分析纯，未做进一步纯化。实验用水均为Millipore MiliQ系统净化超纯水（18.2 MΩ•cm， Millipore, Bedford, MA, USA）。

铅笔芯（Φ 0.38 mm, Hi Polymer 300 EB, Japan）分别用不同粗细的金相砂纸打磨至Φ 100

SymbolmA@ m。设计制作好一定规格的PCB板，将打磨好的铅笔芯用银导电胶固定到PCB板上（电极长度为单边5 mm），烘干后封胶，并于70 ℃下烘烤至密封胶完全固化，得铅笔芯热电极（HPGE）。镀铂液的组成为3.0 mmol/L H2PtCl6•6H2O和0.5 mol/L H2SO4。实验前, 溶液通氮除氧15 min。采用循环伏安法，扫描电位0～－0.3 V（vs. SCE），扫速为100 mV/s, 扫描50圈，即得镀铂铅笔芯热电极（Pt/HPGE）。

2.2 实验方法

采用三电极系统，铂片电极（99.9%，Goodfellow, UK）为对电极, 饱和甘汞电极（上海辰华仪器公司）为参比电极。工作电极在PBS（pH 7.4）中0～0.8 V循环扫描10圈更新。将发光池清洗干净，移取10 mL PBS（pH 7.4）缓冲液于发光池中，分别加入1 mL 1.0 mol/L KCl，100

SymbolmA@ L 4.0 mmol/L Ru（bpy）32＋及100

SymbolmA@ L 0.1 mmol/L C2O42－。工作电极和对电极固定好后置于溶液中，工作电极正对着光电倍增管PMT （高压设为 －750 kV。对电极施加0.4～1.4 V 的电位扫描，同时记录发光信号。以一定电位下发光峰的峰值为ECL 强度，并以加入核黄素前后的发光信号差（ΔI＝I0－ Is）对核黄素定量分析。

样品预处理：取10片维生素片（VB2）研细，称取适量粉末，用水溶解后超声20 min, 以3000 r/min离心20 min, 取上层清液过滤，以水稀释至RF浓度约为0.2 mmol/L, 于4 ℃冰箱保存。检测时，以PBS稀释至所需浓度。

分 析 化 学第39卷

第12期吴爱红等： 核黄素在镀铂铅笔芯热电极上的电致化学发光检测

3 结果与讨论

3.1 Pt/HPGE的表征

将HPGE和Pt/HPGE分别置于0.5 mol/L H2SO4溶液中，在室温下考察其循环伏安行为（图1A）。HPGE在H2SO4溶液中基本上没有电化学响应，而在Pt/HPGE上则明显观察到Pt的特征峰，即活性物质氧和氢的吸附和脱附峰，说明该电极具有与纯Pt电极类似的电化学性质，即Pt已经成功地修饰到电极表面。用SEM表征镀铂前后电极的表面形貌（图1B），在铅笔芯电极表面均匀地镀上了一层Pt粒子，其粒径约为150～200 nm。Pt镀层的存在，极大增加了电极的有效面积。[TS（][HT5”SS]图1 A. HPGE和Pt/HPGE在0.1 mol/L H2SO4中的CV图; B. 电极升温曲线; C. 电极表面SEM表征图

Fig．1 A. CVs of heated pencil graphite electrode （HPGE） and Pt/HPGE in 0.1 mol/L H2SO4; B. Relationship between temperature rise and heating current; C. SEM images[HT][TS）]

采用文献[13]报道的电势测温法可得到电极表面温度差（ΔT）与加热电流平方（I2）的关系。如图1C，在相同的加热电流下, Pt/HPGE表面能够上升的温度明显比HPGE高。这可能是由于金属铂比碳基底具有更好的导电性引起的。

3.5 电极的重现性

采用平行制备的5根电极测定Ru（bpy）32＋C2O42－的响应情况，相对标准偏差为6.0%。对于同一根电极，由于RF在电极表面会有一定程度的吸附，因此需对工作电极进行更新处理。如前所述，电极可以通过在PBS溶液（pH 7.4）中循环扫描而得到更新。分别在常温18 ℃及加热电极到38 ℃时，对1.33×10－8 mol/L RF进行多次平行测定，每次重新测定前均用上述方法更新电极，ΔIECL相对标准偏差（RSD，n＝9）分别为5.4%和5.1%，表明电极具有良好的重现性。

3.6 干扰研究

研究了某些无机离子及生物活性物质对核黄素ECL检测的干扰情况。当RF浓度固定为1.0

SymbolmA@ mol/L时，100倍的Ca2＋, Mg2＋, Fe2＋, Zn2＋, Cu2＋, SO42－和NO3－，50倍的抗坏血酸、烟酰胺、环糊精、淀粉、柠檬酸根、乳糖、葡萄糖和蔗糖对其测定都无明显干扰（相对误差

3.7 维生素片中核黄素含量的测定

当电极表面温度升高到58 ℃时，采用标准加入法对实际样品进行定量测定和回收率实验，（表1）。实验测得RF的回收率在97.0%～106.0% 之间，实际样品中RF测得量平均为标示含量的102.8%，说明本方法可用于实际药物中RF的分析检测。

References

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Determination of Riboflavin by Electrochemiluminescence at

Platinum Coated Heated Pencil Graphite Electrode

WU AiHong, SUN JianJun*, WU ShaoHua

（Key Laboratory of Analysis and Detection Technology for Food Safety, Ministry of Education,

College of Chemistry and Chemical Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350002）

Abstract A platinum coated heated pencil graphite electrode （Pt/HPGE） was fabricated and its properties were characterized by cyclic voltammetry （CV） and scanning electron microscopy （SEM）, etc. It was demonstrated that Pt/HPGE had unique properties such as cheapness, easy preparation, good reproducibility and sensitive temperature response. The Pt/HPGE was employed to detect riboflavin （RF） sensitively based on the quenching effect of RF on Ru（bpy）32＋/C2O42－ electrochemiluminescence （ECL） system. The limit of detection was 1.9×10－10 mol/L （S/N＝3） at an electrode temperature of 58 ℃, which clearly lower than that at room temperature. The method was applied to the determination of RF in vitamin pills with an average recovery of 102.8%.

Keywords Platinum coating; Pencil graphite; Heated electrode; Riboflavin; Electrochemiluminescence

（Received 26 March 2011; accepted 17 June 2011）