电针刺激和缺血预处理对猪心脏缺血再灌流损伤心肌功能的保护

(上海第二医科大学附属仁济医院,上海200127)

[摘 要] 目的:观察电针刺激和缺血预处理对再灌注损伤心肌的保护作用。

方法:将18头小型猪建立急性心肌缺血模型,随机分为3组,对照组(组Ⅰ)、缺血预处理组(组Ⅱ)、针刺加缺血预处理组(组Ⅲ)。于缺血前10min,缺血20min,再灌注20min、60min自左心耳采取标本,抽提组织总RNA,对HSP70mRNA进行定量,经静脉抽取血样本,测定CPK,CKMB,SOD,MDA。超声多谱勒测定冠状动脉血流量(CAF)。

结果:①再灌注20min和60min时,组ⅠSOD值逐步降低(P

结论:电针刺激可明显增强预适应拮抗心肌缺血再灌注造成的心肌损伤,针刺和预适应对心肌保护有协同作用。

[主题词] 电针;心肌再灌注损伤;丙二醛/代谢;超氧化物歧化酶/代谢ProtectiveEffectsofElectroacupunctureandPretreatedIschemiaonIschemia/rep

erfusioninducedMyocardialDysfunctioninthePigWangXiangrui,ChenChangzhi,ZhouJia,etal.(RenjiHospitalAffiliatedtoShanghaiSecondMedicalUniversity,Shanghai200127)[Abstract] Purpose Toinvestigatetheprotectiveeffectofelectroacupuncture(EA)andpretreatedischemiaonischemia/reperfusioninducedmyocardialdysfunction.Methods Eighteenpigswithmyocardialischemiaandreperfusionwereevenlydividedinto3group

satrandom:thecontrolgroup(GroupⅠ),pretreatedischemiagroup(GroupⅡ)andacupuncturepluspretreatedischemiagroup(GroupⅢ).Myocardialtissuesattheleftatriumweretakenat10minbeforeand20minafteri

schemia,20minand60minafterreperfusion,respectively,forextracting

thetotalRNA.TheconcentrationofmRNAwasmeasuredbyRTPCR.CPK,CKMB,superoxidedis

mutase(SOD)andmalondialdehyde(MDA)valuesweredetermined.Thecoronaryarteryflow(CAF)wasmeasuredbytheDopplerultrasoundtechnique.Results ①TheSODactivitydecreasedgraduallyinGroupⅠ,whileittendedtoincreaseinGr

oupⅡandⅢat20minand60minafterreperfusion.TheMDAcontentinGroupⅠwasobviouslyhigherthanthateitherinGroupⅡorinGroupⅢ.②ThevaluesofCK,CKMBinallthe3groupswereelevated,comparedwiththebasevalues(P

[Keywords] Electroacupuncture;MyocardialReperfusionInjury;Malondialdehyde/metab;Supe

roxidedismutase/metab

心肌缺血后恢复血液灌注可出现心肌不可逆性改变,由于微血管的变化,仍可使部分心肌不能得到血液供应,严重损伤心脏功能,缺血预处理可减轻再次缺血造成的心肌损伤[1]。临床研究表明电针刺激对缺血心肌有保护作用[2],但电针刺激合用缺血预处理是否会有协同或拮抗作用未见报道。为此,本实验在猪心肌缺血再灌注模型上,观察电针刺激和缺血预处理对再灌注损伤心肌的保护作用,并探国家自然科学基金资助(NO39670898)卫生部科研基金资助(NO982314)

索其作用机理。

1 材料与方法

1.1 术前准备实验用小型猪15～20kg18头,由上海大学农学院实验中心动物所提供,雌雄不拘。麻醉前禁食12h,硫喷妥钠(20mg/kg)腹腔注射,行气管插管,接呼吸机,定时血气分析以调整呼吸频率、潮气量,使PetCO2,血pH保持在生理范围。吸入异氟醚,间断注射维库溴铵维持麻醉。

1.2 动物模型制作分离右股动脉,22G导针管并连接压力换能器测定平均动脉压(MAP)及采血标本,经左股静脉插入肺动脉导管监测心排血量。分离右颈内静脉置入静脉导管作输液。沿前正中线切开胸骨,在左冠状动脉与前降支交界处分离冠状动脉,超声流量探头置于紧靠冠状动脉下,另一端连于血流计。无损伤血管钳沿结扎线夹住血管,血流计显示冠状动脉血流为零,局部心肌变暗红,心电图示ST明显抬高为模型制作成功。

1.3 分组随机等分为3组,Ⅰ组:对照组(n=6),钳扎冠脉左室支,缺血20min后放开血管。Ⅱ组:缺血预处理组(n=6),先钳夹血管5min,放开10min,再钳夹血管20min。Ⅲ组:电针刺激加缺血预处理组(n=6),气管插管后针刺刺激两侧“内关”、“列缺”和“云门”穴,进针后接G6805针麻刺激仪,脉冲频率为3～4Hz,针刺诱导时间为20～30min,其它方法同缺血预处理组。

1.4 测定指标(1)代谢指标:于钳扎前(对照值)、解除钳扎后20min、60min分别由股动脉采血,测定血浆中丙二醛(MDA)的含量,化学比色法测定SOD活性,自右颈内静脉导管抽取近右心房处血标本,采用日立7150全自动分析仪测定肌酸磷酸激酶(CPK)及肌酸磷酸激酶同功酶(CKMB)。

(2)采用超声多谱勒血流仪于缺血前10min、再灌注20min、再灌注60min测定冠状动脉血流量(CAF)。

(3)心肌细胞热休克蛋白测定:于缺血前10min,缺血20min,再灌注20min、60min分别自左心耳剪下1mm×1mm×1mm标本,放入液氮中保存。应用Reagent抽取组织总核糖核酸(RNA),通过匀浆化、分离、洗涤、溶解、沉淀分离总RNA,紫外分光光度仪测定RNA浓度,加入随机引物的探针,经RTPCR扩增后,溴芬蓝染色在0.8%胶走电泳,以123Mark标记分子量,显色后斑点杂交膜用密度扫描仪(岛津CS-920型)对HSP70mRNA进行定量。1.4 统计学处理数据以x±s表示,用SAS软件包处理,组内作配对t检验,组间作方差分析,均数间两两比较用NewmanKeuls检验。

2 结果

2.1 心肌代谢指标再灌注20min和60min时,3组CPK、CKMB均较对照值明显升高(P

表1 3组心肌缺血猪再灌注过程中生化指标的变化

2.3组HSP70mRNA含量的比较通过斑点切迹杂交显色,可见组ⅠHSP70mRNA表达低于组Ⅱ和组Ⅲ,斑点切迹经薄层扫描仪定量,其密度值见表2。

表2　3组心肌缺血猪再灌注前后心肌

2.3 再灌注20min时,3组CAF均较对照值明显减低,再灌注60min时,Ⅰ组CAF仍明显低于对照值,Ⅲ组的冠脉血流量明显大于Ⅰ组(P

表3 3组心肌缺血猪再灌注前后冠脉血流的变化

3 讨论

重度心肌血流量减少多导致乳酸堆积增加和糖原耗竭,心肌收缩功能重度受损或完全丧失,长时间缺血,则发生心肌细胞溶解和坏死,在缺血心肌细胞中,内源性保护机制将被激活,细胞内发生许多变化,包括细胞内钙水平增加,膜损害,自由基产生,三磷酸腺苷(ATP)水平下降,氧耗竭等,以上造成代谢或缺氧应激。研究表明缺血再灌注时期对机体的损伤明显大于缺血期[3]。引起心肌缺血再灌注损伤机制复杂,氧自由基的爆发生成是其主要机制之一。MDA的浓度为膜脂质过氧化损害程度的标志,氧自由基作用于细胞外基质,使胶原和透明质酸崩解;促使膜磷脂结构内的多聚不饱合脂肪酸过氧化而直接损伤细胞膜;肌浆网和线粒体破裂[4]。氧自由基的产生主要是发生在血流恢复灌注后,本实验对照组在再灌注20min、60min时MDA含量明显升高,SOD含量明显下降,表明复氧后氧自由基的产生与清除这个平衡系统被破坏,使体内MDA含量明显升高。电针刺激加缺血预处理组和缺血预处理组MDA含量的增加明显低于对照组,且SOD轻度增加,表明缺血预处理促进心肌氧化磷酸化过程,提高氧利用率和ATP产生的效率,有利于保持细胞膜的完整性,减轻线粒体损伤,保护线粒体的各种酶系统。电针刺激通经络,行血气,调虚实,对缺血预处理提高氧利用率有协同作用。笔者经大量的动物和临床实验确定了本组针刺穴位,几十年来已完成了近千例针麻心内直视手术,病人术后恢复快。

心脏缺血预处理的保护作用涉及许多内源性保护物质的产生与释放。当机体受到应激因子刺激,组织细胞可产生应激蛋白,对机体产生自身保护作用,热休克蛋白属一类应激蛋白,针刺和预处理诱导内源性蛋白类保护物质合成增加,可能是心肌保护作用的物质基础,减轻心肌缺血―再灌注损伤,提高缺血后心脏的机械功能,有利于ATP的保存和保护线粒体功能[5]。本实验表明再灌注20min、60min时,针刺和缺血预处理组心肌细胞HSP70mRNA基因表达率明显大于对照组。HSP70的保护作用主要是通过促进变性蛋白质的复性/水解,维持蛋白质的结构,促进新合成的蛋白质取代老化蛋白质[6],并可以保持正常或部分变性蛋白的四级结构,协助大分子蛋白或肽从线粒体和内质网的跨膜转运,从而保护缺血的细胞。其保护作用主要在缺血期和缺血后早期,晚期的合成不能阻止细胞的死亡[7]。电针刺激加缺血预处理组心肌再灌注后冠脉血流量的恢复优于缺血预处理组。因此,针刺可以加强缺血预处理对缺血心肌的内源性保护物质的产生与释放,其作用机理仍有待进一步的研究。

4 参考文献

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(修回日期:2001-02-19,齐淑兰发稿)