时间：2022-06-24 02:32:07
【摘要】目的 观察聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）及核因子kappa B（NF-κB）在重症急性胰腺炎（SAP）大鼠腺垂体中的表达，并探讨其在SAP大鼠腺垂体损伤中的作用。方法 雄性Wistar大鼠40只，随机（随机数字法）分为5组（n=8）：假手术组（SO组）及重症急性胰腺炎组（SAP组）1、3、6、12 h组。胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠制备重症急性胰腺炎模型。测定腹水量，血清淀粉酶、脂肪酶水平。光镜观察胰腺及垂体病理改变，电镜观察垂体超微结构改变。免疫组化观察垂体PARP及NF-κB的表达。结果 SAP组血清淀粉酶、脂肪酶水平及胰腺病理学评分逐渐增加，均较SO组明显升高（P
【关键词】重症急性胰腺炎；腺垂体；超微结构；聚腺苷二磷酸核糖聚合酶
Changes of PARP and NF-κB in adenohypophysis of rat model of severe acute pancreatitis DENG Wen-hong，ZHAO Kai-liang，YANG Bo，SHI Qiao，ZHOU Xing， WANG Wei-xing.Department of General Surgery， Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan430060， China
Corresponding author：WANG Wei-xing，Email：
【Abstract】Objective To investigate the changes of poly-ADP-ribose polymerase （PARP） and NF kappa B （NF-κB） in adenohypophysis in rat model of severe acute pancreatitis （SAP）， and their role in the mechanism of adenohypophysis injury in SAP. Methods Forty Wistar rats were randomly（random number） divided into 5 groups：the sham operation group （SO group， n=8），SAP 1 h，3 h，6 h and 12 h groups （n=8 in each group）. SAP model was induced by retrograde injection of 5% sodium taurocholate into the biliopancreatic duct. Serum levels of amylase， lipase and ascites were measured. After sacrifice of experiment rats， pancreas and adenohypophysis tissues were taken for pathological examination under light microscope. Adenohypophysis cells were observed under electronic microscopy as well. PARP and NF-κB expressions in adenohypophysis cell was studied by using immunohistochemisty assay.Results After modelling. serum levels of amylase， lipase and ascites in SAP group increased gradually， which were higher than those in SO group （P
【Key words】Severe acute pancreatitis； Adenohypophysis； Ultrastructure； Poly （adp-ribose） polymerase
急性胰腺炎是临床上常见的急腹症之一。大部分患者属于轻型胰腺炎，其临床表现较轻微，可以获得痊愈；大约10%～15%的患者发展为重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP），最终导致全身炎症反应综合征和多器官功能衰竭[1]。研究发现，重症急性胰腺炎时存在胰外脏器的损伤，如肺、肝、肾、肾上腺等[2-5]。目前对重症急性胰腺炎时腺垂体损伤的实验研究较少，主要是对临床急性胰腺炎患者垂体分泌功能的研究[6]。由于神经垂体本身不分泌激素，本文暂不探讨其变化及意义。
聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly （ADP-ribose） polymerase， PARP）]是一类普遍存在于真核细胞的多功能蛋白质翻译后修饰酶，主要存在于细胞核内，广泛参与细胞DNA损伤修复和炎症介质释放[7-8]。研究证实，PARP可通过活化NF-κB参与急性胰腺炎时肝、肾、肺等胰外脏器的损伤[9-11]。
因此，本文重点观察聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）和核因子κB（NF-κB）在重症急性胰腺炎大鼠腺垂体中的表达，并探讨其在SAP大鼠腺垂体损伤中的作用，以便为进一步明确急性胰腺炎腺垂体损伤的发病机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与动物
牛黄胆酸钠购自Sigma公司，PARP-1抗体购自Aleixs公司，NF-κB P65抗体购自Sigma公司。雄性Wistar大鼠40只（湖北省疾病预防控制中心提供），SPF级，体质量200～250 g。随机（随机数字法）分为5组（n=8）：假手术组（SO组）、重症急性胰腺炎组 （SAP组1、3、6、12 h）。
1.2 模型制备及标本采集
重症急性胰腺炎模型的制备：大鼠术前禁食12 h，不禁水。以戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉，5%牛磺胆酸钠溶液（1 ml/kg）沿胰胆管逆行注射造模。SO组仅翻动胰腺后关腹。模型制备成功后分别于1、3、6、12 h分批处死大鼠。心脏采血，离心后分离血清于-20 ℃保存备用，取胰头部胰腺及垂体组织经多聚甲醛固定，行常规HE及免疫组织化学观察；另取垂体组织以2.5%戊二醛固定后送电镜观察。其余组织经液氮速冻后，转入-80 ℃冰箱保存备用。
1.3 检测指标
腹水量测定：用电子分析天平分别记录干棉球（干质量，mg）及汲取腹水后的质量（湿质量，mg），计算腹水量（mg）=湿质量-干质量。
生化指标：采用本院检验科全自动生化分析仪测定血清淀粉酶（AMY）、脂肪酶水平。
组织病理学标本检测：大鼠胰腺及垂体组织用10%甲醛固定24 h，石蜡包埋切片，行HE染色，根据Schmidt等[12]提出的方法，对胰腺水肿、胰腺腺泡坏死、出血和脂肪坏死、炎症和血管周围炎性浸润光镜下进行病理评分。垂体组织根据间质出血、细胞水肿、细胞坏死、细胞凋亡、炎性细胞浸润判断病理损伤程度。
电镜标本制备与观察：取新鲜大鼠垂体组织，迅速将其浸泡于2.5%戊二醛溶液中行前固定，1%锇酸行后固定，梯度酒精-丙酮脱水，EPON812包埋机（美国）包埋，LKB-V型超薄切片机（美国）超薄切片，醋酸双氧铀-枸橼酸铅染色，日立H-300型透射电镜观察、照像。免疫组织化学检查：大鼠垂体组织用10%甲醛固定24 h时，石蜡包埋切片，采用SP法行免疫组织化学检查。
1.4 统计学方法
计量资料均以均数±标准差（x±s）表示，多组间进行单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P
2 结果
2.1 腹水量、血淀粉酶、脂肪酶、胰腺病理评分
SAP组各时间点大鼠腹水量以及血淀粉酶、脂肪酶活性逐渐升高，且均高于SO组（P
2.2 胰腺大体结构及病理变化
SO组：肉眼观胰腺呈淡粉色，均匀一致、几乎无水肿，极少量腹水；光镜下胰腺腺泡结构正常。SAP组：1 h胰腺组织肉眼见水肿明显，较少量的细胞出血、坏死；3 h水肿明显，出血、坏死严重程度增加；6 h可见腹腔内轻度粘连，可出现血性腹水及少量皂化斑，腺体颜色呈暗红色；12 h腹腔脏器粘连严重，可见大量腹水及皂化斑，胰腺呈红褐色。光镜下SAP组1、3、6、12 h时间点出现明显水肿、出血、腺泡及胰周脂肪坏死及炎性细胞浸润；且随时间进展，胰腺坏死程度逐渐加重、范围明显扩大。见图1。
2.3 垂体大体结构及病理变化
大体观，SO组垂体大体观呈粉红色，颜色均匀一致。SAP组各时间点垂体大体观与SO组无异，未见出血及水肿。镜下腺垂体病理改变：与SO组相比，SAP组大鼠腺垂体在造模后早期有细胞间隙增宽，嗜碱性细胞水肿，毛细血管充血等改变，随时间延长，细胞水肿加重，胞内出现空泡，至12 h时点，镜下可见嗜碱性细胞核肿胀，包膜不完整，局部出现细胞坏死及凋亡现象。见图2。
2.4 腺垂体超微结构变化
SO组大鼠腺垂体细胞正常，胞膜及核膜完整，胞质内散在分布着粗面内质网、线粒体不肿胀，高尔基复合体、低密度分泌颗粒均匀分布。SAP组大鼠腺垂体细胞在早期可见粗面内质网增生，分泌颗粒增多，3 h后出现细胞核不规则，核周间歇增宽；粗面内质网普遍扩张、脱颗粒；线粒体肿胀；分泌颗粒在胞质内分布不规则；12 h时点可见染色质凝集，胞核固缩，内质网高度肿胀，细胞内存留大量分泌颗粒，线粒体肿胀明显，线粒体嵴断裂，部分线粒体出现空泡化。见图3。
2.5 腺垂体PARP-1免疫组化结果
PARP-1阳性表达为视野内组织被染成棕黄色。SO组腺垂体组织中表达微弱，SAP组随时间延长，PARP-1高表达于核内，并逐渐增强，12 h时点达高峰，SAP组PARP-1阳性表达均较SO组明显升高。见图4。
2.6 腺垂体NF-κB免疫组化结果
NF-κB阳性表达为视野内组织被染成棕黄色。SO组腺垂体组织中表达微弱。SAP组随时间延长，NF-κB高表达于核内，并逐渐增强，12 h达高峰，SAP组NF-κB阳性表达均较SO组明显升高，见图5。
3 讨论
在本实验中，根据胰腺原位损伤、腹水及血清学淀粉酶、脂肪酶，提示重症急性胰腺炎（SAP）是一种病情危重、进展迅速的疾病。研究发现患者在急性胰腺炎时存在腺垂体分泌功能的改变[6]。聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶酶 （PARP），是细胞内一种重要的蛋白质翻译后修饰酶，主要存在于细胞核内，少量存在于细胞浆内。在人体内，PARP 家族至少有18个成员，包括 PARP-1、PARP-2、PARP-3、PARP-4、PARP-5和Tankyrases等[13-14]。PARP-1参与细胞内多种生理活动，包括DNA损伤修复、能量代谢、基因转录调控、细胞坏死和凋亡、染色质功能、基因稳定性、蛋白降解等[15-17]。研究发现，PARP-1在休克、缺血、再灌注损伤及脓毒血症中，参与炎症介质的传递[7， 18]。在急性胰腺炎中，PARP-1参与了胰腺细胞凋亡和坏死的发病机制[18-20]。
PARP-1主要通过以下两种机制促进疾病的进展：（1）参与细胞损伤修复 PARP-1作为一种DNA断裂的敏感原件和信号分子，当机体和细胞受到胰腺炎刺激时，通过应激损伤引起DNA断裂，DNA的断裂引起PARP-1的活化，形成二聚体，使氧化型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）裂解为烟酰胺和腺苷酸二磷酸，并进一步形成聚腺苷二磷酸核糖聚合体（PAR）。此聚合体一方面可以催化合成DNA损伤修复的原材料，另一方面可以使细胞核内组蛋白带负电荷，使得组蛋白和DNA产生静电排斥效应，有助于损伤部位DNA双螺旋的解聚及损伤的修复。相反，细胞在DNA损伤修复的同时，需要消耗大量NAD+，而NAD+直接参与细胞线粒体内呼吸链的电子传递过程，过度消耗NAD+会使得细胞内能量耗尽，线粒体肿胀及功能丧失，最终引起细胞死亡[21-23]。（2）催化炎症反应 PARP-1活化可以直接催化核内细胞因子活化，其中研究最多的是NF-κB。NF-κB是细胞核内重要的转录因子，在正常情况下，NF-κB与细胞质内IκB分子结合。当炎症、肿瘤、应激等刺激时，IκB分子磷酸化降解，NF-κB迅速进入细胞核内，调节基因的转录，进一步调控多种炎症基因的表达，如TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1等[24-25]。研究证实，PARP-1可以活化NF-κB及其下游的信号分子，如TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、ICAM-1、COX2、NO等，它直接参与炎症反应的发展，且应用PARP抑制剂可以明显改善炎症损伤[14， 23， 26]。
在本实验中，腺垂体光镜HE染色提示重症急性胰腺炎发病早期存在腺垂体细胞水肿，至12 h出现凋亡以及坏死。值得一提的是，在大鼠腺垂体中，未见明显的炎性细胞浸润，可能与大鼠体内的血脑屏障有关，此屏障可阻止炎性细胞通过。但是一些小分子的前炎症因子及内生性PARP-1活化因子可通过此屏障，到达腺垂体，引起腺垂体PARP-1活化[21]，并进一步活化NF-κB介导炎性损伤，引起细胞水肿及死亡[21， 27]。笔者观察到健康对照组大鼠腺垂体组织中微量表达PARP-1及NF-κB，细胞核内未见表达。重症急性胰腺炎大鼠腺垂体细胞在核内明显表达PARP-1及NF-κB，且随时间延长表达增强，从而反映出PARP-1及NF-κB分子在胰腺炎刺激作用下，迅速转移至细胞核内活化，参与机体的炎症反应。
以上现象可能的机制为SAP早期存在应激反应，这与本团队前期研究的研究一致[28]，SAP早期，腺垂体细胞内线粒体功能亢进，胞内分泌颗粒释放入血，调节机体应激反应，电镜下可见残存于胞内的分泌颗粒较少。至SAP后期，由于线粒体不能提供足够的能量将分泌颗粒排除入血，使得分泌颗粒滞留，另外过度地消耗NAD+会使细胞内能量耗尽，线粒体肿胀及功能丧失，最终引起细胞死亡。本实验也观察到SAP组12 h时点线粒体高度肿胀，细胞核固缩等超微结构改变。
综上所述，本文研究发现在SAP时，大鼠腺垂体出现病理结构及超微结构改变，且PARP及NF-κB通路的变化可能参与了腺垂体细胞损伤的机制。笔者下一步将应用PARP抑制剂进行研究，观察PARP抑制剂对腺垂体细胞的保护作用。另外，对PARP-1在各种腺垂体细胞中的作用尚需要进一步研究。
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（收稿日期：2013-04-06）
DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2013.10.004
基金项目：国家自然科学基金面上项目（81070368）；中央高校基本科研业务费专项资金（4104003）
作者单位：430060 武汉，武汉大学人民医院普外科
通信作者：王卫星，Email：
P1090-P1095