益气养血补肾方对环磷酰胺致大鼠白细胞减少的影响

[摘要] 目的：探讨益气养血补肾方对环磷酰胺(CTX)致白细胞减少症大鼠的作用机制。方法：用CTX建立白细胞减少症大鼠模型，用益气养血补肾方治疗，观察大鼠外周血WBC、骨髓有核细胞数及血清GM-CSF水平的变化。结果：益气养血补肾方治疗组大鼠外周血WBC、骨髓有核细胞计数、血清GM-CSF含量明显回升，与模型对照组相比较有显著差异(P＜0.01)。结论：益气养血补肾中药对CTX所致的外周血白细胞数下降具有明显的对抗作用，且在升白细胞上存在一定的量效关系。

[关键词] 益气养血补肾；白细胞减少症；GM-CSF

[中图分类号] R285 [文献标识码]B[文章编号]1673-7211（2008）11（b）-039-02

The influence of Yiqi Yangxue Bushen Fang on leukopenia result from cyclophosphamide

BI Lian1 ,WU Xiao-yong2

(1.Medical Department, the First Affiliated Hospital, Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang550002, China; 2. Beijing University of Chinese Medicine 2007 Ph.D, Beijing100029, China)

[Abstract] Objective: To discuss the mechanism of Yiqi Yangxue Bushen Fang (YYBF) leukopenia result from cyclophosphamide. Methods: We treated the leukopenia rat model result from cyclophosphamide with YYBF and observed peripheral blood WBC, marrow nucleated cells and the levels of GM-CSF in serum. Results: YYBF could enhance peripheral blood WBC, marrow nucleated cells and GM-CSF of the leukopenia rat model, compared with the model group, had significant difference (P＜0.01). Conclusion: YYBF can enhance peripheral blood WBC of leukopenia result from cyclophosphamide, but there is a certain dose-effect relationship.

[Key words] Yiqi Yangxue Bushen; Leukopenia; GM-CSF

近年来，恶性肿瘤的发病率呈明显上升趋势，放疗、化疗均是治疗恶性肿瘤常用的有效手段，但放化疗对骨髓抑制均较严重，容易引起白细胞减少等副作用。本实验通过建立化疗后白细胞减少大鼠模型，观察益气养血补肾中药对其WBC计数、骨髓有核细胞计数及GM-CFS的影响，初步探讨该方治疗白细胞减少症的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠，普通级，月龄3～4个月，体重(280±20) g，雌雄各半，共50只，由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(黔)2002-0001。

1.2药品与试剂

1.2.1药品益气养血补肾方由黄芪、当归、补骨脂、鸡血藤、茜草等组成(贵阳中医学院一附院中药房提供)，将以上药物按临床用药比例用蒸馏水浸泡30 min，煎煮2次(30 min/次)后，过滤后分别制成122.5%、367.5%的两种水煎浓缩液(含生药量分别为1.225、3.675 g/ml)，4℃保存备用；利血生(江苏吉尔药业有限公司生产)20 mg/片，溶于蒸馏水制备成0.21%药液(0.0021 g/ml)待用；环磷酰胺(CTX)(上海华联制药有限公司)，用0.9%氯化钠注射液(湖南科伦制药有限公司)稀释。

1.2.2 试剂GM-CSF免疫试剂盒，北京华英生物技术研究所生产。

1.3 仪器

光学显微镜，KDC-2044低速冷冻离心机(中国科技大学科技实业总公司中佳光电仪器公司生产)；GC-1200 r放射免疫计数器(科大创新股份有限公司中佳分公司生产)。

1.4 方法

1.4.1 模型的制作据《新药(西药)临床前研究指导汇编(药效学・药理学・毒理学)》[1]及王晨[2]方法加以改良，用CTX 40 mg/kg腹腔注射，1次/d，连续5 d，建立白细胞减少动物模型。

1.4.2 分组及给药将50只大鼠随机分成5组，每组10只，即空白对照组(A组)、模型对照组(B组)、利血生组(C组)、小剂量益气养血补肾方组(D组)、大剂量益气养血补肾方组(E组)。除A组按体重腹腔注射等剂量的生理盐水外，其余4组均用环磷酰胺造模。造模各组自造模之日起，分别按体重及临床用药比例予生理盐水、利血生、小剂量益气养血补肾方汤液、大剂量益气养血补肾方汤液灌胃。

1.5 观察指标

1.5.1 白细胞计数[3] 分别于模前及模后第1、3、5、7、9、11天割破大鼠尾静脉取血20 μl，加入白细胞稀释液0.38 ml中，混匀，滴入计数盘，静置2～3 min，低倍镜下计数。

1.5.2 骨髓有核细胞计数于造模结束后第11天，处死大鼠，立即取出股骨，用10 ml 3%醋酸溶液冲出骨髓细胞，在血细胞计数盘上计数四个大方格的细胞数，然后乘以2.5×104，即得1根股骨中骨髓有核细胞总数[4]。

1.5.3 血清GM-CSF测定用125I放射免疫试剂盒测定血清GM-CSF，按照产品说明书进行操作。

1.6 统计学处理

用SPSS 11.5统计软件，数据以均数±标准差（x±s）形式表示，组间用t检验，P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01表示有非常显著性差异。

2 结果

2.1 大鼠外周血白细胞计数的变化

各模型组白细胞数在造模结束后第1、3天明显低于空白对照组(P＜0.01)，B组至实验结束与A组比较仍有极显著差异(P＜0.01)；各治疗组白细胞均有回升，造模结束后第5天起，与模型对照组比较具有极显著差异(P＜0.01)，E组和C组在造模结束后第9天与空白对照组无显著差异(P＞0.05)，D组则在造模结束后第11天与空白对照组无显著差异(P＞0.05)，见表1。

2.2 骨髓有核细胞计数、GM-CSF的变化

CTX导致大鼠骨髓有核细胞、血清GM-CSF含量显著减少，各治疗组皆能增加骨髓有核细胞数、血清GM-CSF含量，且利血生组与大、小剂量益气养血补肾方组具有同等功效，组间比较无差异(P＞0.05)，见表2。

表2骨髓有核细胞计数、GM-CSF的变化

3 讨论

中医学认为放化疗导致白细胞减少等副作用，是由于放化疗损伤人体气血津液，伤及五脏六腑，毒邪内蕴，肝肾亏损所致，根据其临床表现，可归属中医“虚劳”范畴。遵循中医“虚则补之”、“治病求本”的原则，益气养血，平衡阴阳，扶正祛邪，可调节机体内环境，减轻或消除放化疗对机体的损害。益气养血补肾方由黄芪、当归、补骨脂、茜草、鸡血藤等组成，研究表明[5-10]：上述药物有提高免疫功能、抗肿瘤、抗辐射、保护造血干细胞、改造骨髓微环境、促进粒细胞增殖、分化等作用。GM-CSF在正常造血细胞的增殖分化过程中是一种重要的造血正性调控因子，它是一种能促进骨髓粒系、单核细胞系、巨噬细胞系发育和成熟，增加外周血成熟粒细胞、单核巨噬细胞功能的一种细胞因子[11]。

本实验结果提示，益气养血补肾方治疗组大鼠外周血WBC、骨髓有核细胞计数、血清GM-CSF含量均明显回升，与模型对照组相比较有显著差异(P＜0.01)，对CTX所致的外周血白细胞数下降具有明显的对抗作用。其中大剂量益气养血补肾中药治疗组对CTX致白细胞减少症大鼠模型有明显治疗作用，使造模后动物死亡率降低，WBC明显上升，骨髓有核细胞数量恢复正常，血清GM-CSF水平上升。根据白细胞动力学过程分析，在正常造血情况下，从粒系祖细胞到成熟粒细胞再进入外周血大约要经过236～284 h(9.8～l1.7 d)[12]。益气养血补肾中药升高外周血白细胞的机制可能是刺激贮藏在贮存池和边缘池的白细胞释放；或通过拮抗CTX对骨髓微环境及免疫细胞的损伤，修复损伤的细胞，改善骨髓造血微环境，促使GM-CSF的生成与分泌或增强其活性，进而刺激骨髓造血干细胞增殖、分化、成熟和释放，恢复正常的造血功能。

[参考文献]

[1]中华人民共和国卫生部药政司[M].新药(西药)临床前研究指导汇编(药效学・药理学・毒理学),1993.103-104.

[2]王晨,齐笑庸,洪宝源.小鼠注射环磷酰胺后CFU-S脾集落形成的实验观察[J].中华血液学杂志,1994,15(3):287.

[3]李家增,王鸿利,韩忠朝,等.血液实验学[M].上海:上海科学技术出版社,1997.348.

[4]施献猷.医学动物实验方法[M].北京:人民卫生出版社,1980.228.269.279.

[5]许杜娟,陈敏珠.黄芪总提物减弱荷瘤小鼠化疗引起的白细胞减少和免疫抑制作用[J].安徽中医学院学报,2006,25(3):34.

[6]和建峰,张琰,贺建荣.黄芪多糖对小鼠化疗中白细胞和骨髓有核细胞减少的影响[J].中国现代应用药学杂志,2003,20(5):378.

[7]张翠兰,文德鉴.当归对血液及造血系统药理作用研究进展[J].湖北民族学院学报医学版,2002,19(4):34.

[8]吴少华,张仲海.补骨脂素体内外抗癌活性的实验研究[J].中国中药杂志,1998,23(5):303.

[9]王艳双,罗速,崔新颖,等.茜草抗肿瘤作用及其机制研究[J].北华大学学报(自然科学版),2005,6(6):499.

[10]刘屏,陈宜鸿,张志萍,等.鸡血藤对环磷酰胺、(60)钴照射后动物血象的影响[J].中药药理与临床,1998,14(3):25.

[11]孙强明.人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子研究进展[J].国外医学・免疫学分册,2000,23(2):86.

[12]徐有恒,王倚如.造血生理学和造血细胞检测技术[M].长沙:湖南科学技术出版社,1997.13.

（收稿日期：2008-04-17）