淫羊藿对LARS韧带周围成骨细胞碱性磷酸酶活性影响的研究

摘要：目的 观察淫羊藿对LARS韧带周围成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）活性影响。方法 将Wistar乳鼠颅骨原代分离培养的成骨细胞接种于nHA、LARS韧带及nHA介导的LARS韧带的表面，同时用淫羊藿去干预，21d时检测ALP活性。结果 nHA表面上ALP活性最高，LARS韧带表面ALP活性最低，LARS韧带介导的nHA表面上ALP活性略高于空白组，但无显著性差异，但当淫羊藿干预后有了显著性差异。结论 淫羊藿结合nHA能明显增加LARS韧带周围ALP的活性，促进成骨细胞的功能及代谢活动。

关键词：LARS韧带； 纳米羟基磷灰石；碱性磷酸酶；淫羊藿

1 资料与方法

1.1淫羊藿提取液淫 羊藿生药购自同仁堂集团公司。淫羊藿提取液按高子范等[1]的方法制备，提取液相当于1.5g/ml生药。

1.2纳米羟基磷灰石制备：①取Ca（NO3）2・4H2O78.7g，加300 ml去离子水配制溶液，加10ml30% 氨水，将pH值调至11～12，稀释到600ml。②取（NH4）2HPO4 26.4g ，用500m去离子水配成溶液，加30%氨水250 ml，将pH调值至11～12，再稀释至1067ml，将沉淀物溶解，测pH值，加30%氨水，使其pH值保持在11～12。③在25℃条件下，将（NH4）2HPO4加至Ca（NO3）2溶液中，同时剧烈搅拌20min，加完后再继续剧烈搅拌24h。④抽滤反应物，无水乙醇洗涤3次，在90℃条件下干燥15h。⑤把干燥样品放入高温炉中煅烧，在1100℃保温1h，再冷却至室温，得到HA粉体。将HA粉体制备成直径10mm、厚2 mm 的圆片型，从室温至1200℃的条件下烧1h，得到纳米HA（nHA） 。

1.3 骨细胞的分离与培养 新生24h以内的Wistar大鼠乳鼠，用75%乙醇浸泡5min。取出颅骨，去净表面的骨膜及软组织， 再浸入DMEM 培养液中， 冲洗2次。在培养皿中剪碎为0.5mm×0.5mm碎片。加0. 25%Ⅰ型胶原酶1ml和PET液5 ml，在孵箱中消化20min，反复吹打，弃上清液，此操作反复3次，取第3次消化后的上清液，于4℃离心5min（1000 r/min），至细胞沉淀。弃上清液，入完全培养液悬起细胞沉淀， 并洗细胞2 次，台盼兰染色显示90%以上细胞存活。将细胞悬液于25 ml培养瓶中，密度为5. 0× 104 / ml，于37℃饱和湿度， 5%CO2 的孵箱中培养。24h后换液，以后隔日要换液1次。将传到第3代的成骨细胞用0.25%胰蛋白酶消化脱壁， 制成悬液， 4℃离心收集细胞，用于接种在实验中各组材料上。

1.4 实验分组 实验分为6组， 即LARS韧带组、LARS韧带加淫羊藿组、nHA 组、内放nHALARS韧带（nHA-LARS）组、nHA-LARS加淫羊藿组及空白组，其中空白组为Φ10mm圆形载玻片。

1.5 细胞接种 在96孔培养板中分别放LARS韧带组、LARS韧带加淫羊藿、nHA 、nHA-LARS、nHA-LARS加淫羊藿以及空白组的圆形载玻片，其中淫羊藿浓度20mg/L，每组4 孔，将传代第3 代的成骨细胞接种至材料的表面（ 密度1.5×104/ ml ），静置片刻后缓慢加入完全培养液1 ml，密闭后置于37℃饱和湿度， 5%CO2 的孵箱中密闭培养7d。

1.6 细胞裂解液制备 成骨细胞接种后第21d将培养板各孔内上清液吸出， PBS 洗去未附着的细胞， 用蒸馏水洗3 次，三次冻融培养的细胞， 吸管反复吹打各孔中细胞1 min，从而制成不同组份的细胞裂解液。

1.7 碱性磷酸酶活性的测定 以上每组10只试管，各试管加100μl上述细胞裂解液， 细胞裂解液与ALP检测试剂盒内500μl反应液混合之后，37℃恒温下反应30 min，变成黄色后加入0.25N NaOH1.5ml终止反应。用MR600紫外光分光光度计于400nm波长处测定溶液的光吸收值。以蒸馏水为空白对照、以对硝基苯酚为标准品绘制标准曲线。依据标准曲线推算各实验组成骨细胞内碱性磷酸酶含量（nmolp-nitrophenol/min/mg・pro 表示）。

1.8 统计学方法 SPSS13.0统计分析软件，计算各组数据的均值和标准差，方差分析比较各组间差异，以P

2结果

nHA表面上ALP活性最高，LARS韧带表面ALP活性最低，nHA介导的LARS韧带表面上ALP活性略高于空白组，但无显著性差异，但当淫羊藿干预后有了显著性差异（ P

3讨论

近来研究发现，淫羊藿具有促进骨骼生长，阻止钙质流失，预防骨质疏松的作用[2]。纳米羟基磷灰石由于表面效应使其表面原子存在许多悬空键，有很高的化学活性，可增加材料生物活性和成骨诱导的能力。实验结果显示，淫羊藿结合纳米羟基磷灰石能明显增加LARS韧带周围ALP的活性，促进成骨细胞的功能及代谢活动，为临床促进LARS韧带在骨隧道内与骨愈合的研究提供了一种思路。

参考文献：

[1] 高子范，扬宗智，马克昌，等.淫羊藿提取液对试管内鸡胚股骨生长的促进作用[J].中西医结合杂志， 1985， 5： 172 - 173.

[2] 殷晓雪，陈仲强，党耕町，等.淫羊藿苷对人成骨细胞增殖与分化的影响[J].中国中药杂志， 2005， 30： 289- 291.