UPLC同时测定白及药材中9种指标成分的含量

[摘要] 采用超高液相色谱（UPLC）的方法，以Acquity BEH C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm） ，流动相为乙腈-水，梯度洗脱，流速为0.3 mL・min-1，柱温45 ℃，检测波长280 nm的色谱条件同时测定白及药材中的4-羟基苯基-葡萄糖苷、4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯-2-葡萄糖苷、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯、二氢菲5和1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯-2-[4-O-肉桂酰基]葡萄糖苷、 二氢菲1、苄基氢菲3和1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯-2-[4-O-肉桂酰基-6-O-乙酰基]葡萄糖苷9个指标成分。各指标成分之间分离度良好，在选定的浓度范围内线性关系良好（r≥0.999 3），平均加样回收率（n=6） 为98.15%～102.2%，RSD为2.1%～3.6%，表明所建立的方法重复性、耐用性良好，结果准确，经对野生和人工种植白及药材分析，野生白及所测定的9种成分含量高于人工栽培白及药材，为白及药材的质量评价和控制提供科学依据。

[关键词] 白及；多指标成分；超高液相色谱（UPLC）

[收稿日期] 2014-01-02

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81360636）；贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目（黔科合中药字[2010]5027号）；贵阳市科学技术计划项目（筑科合同[2012204]20号）

[通信作者] 李勇军，教授，主要研究方向天然药物化学和中药新药研发，Tel：（0851）6908468，E-mail：

白及为兰科植物白及Bletilla striata （Thund.） Reichb. f.的干燥块茎，具有收敛止血，消肿生肌等功效[1]。现代药理研究表明，白及药用功能广泛，药用价值高，具有止血，抗菌，抗肿瘤及促进血管内皮细胞生长等药理作用。另有研究发现白及正逐渐成为我国现代医药工业的重要原材料[2]。但目前白及药材质量控制标准较薄弱，《中国药典》2010年版一部和第二增补版仅收载了性状、薄层色谱鉴别等[3]，无含量测定等重要的质量控制指标，因此难以评价和控制白及的质量。作者在对白及的研究中，曾对白及的多糖和其中含量较高的化合物militarine{双[4-（β-D-吡喃葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯}为指标进行了质量控制研究[4-6]，而白及化学成分有芪类、联苄类、菲类、联菲类、联菲醚类、菲并吡喃类、联苄葡萄糖苷类、菲并螺甾内酯类以及甾体、三萜和花色素苷类等化合物近50种[7-9]，以白及中单一指标含量控制白及药材质量的方法，不能较全面的反映白及整体质量信息。文献报道白及水提物及甲醇提取物是白及止血及抗溃疡的有效部位[9]，国内外对白及的质量控制方法研究主要为多糖、总酚大类成分、单一成分（militarine， 肉桂酸）或某一类成分的分析报道[4-5，10-12]，未见同时测定白及药材中4-（葡萄糖氧）苄醇及肉桂酸酯、2-异丁基苹果酸酯、二氢菲和苄基氢菲类的多指标成分的报道。本研究以白及中分离到的含量较高化合物，应用超高液相色谱法，建立了同时测定白及中9个指标性成分的分析方法，为白及药材的质量控制和评价提供科学依据。

1 材料

Acquity UPLC（美国沃特世公司，包括二元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、色谱柱温箱、阵列二极管检测器、Empower 2工作站）；TGL-16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；1/10万电子天平（AE240，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；超纯水机（四川沃特尔科技发展有限公司）。

白及药材由贵阳医学院药学院生药学与药用植物学教研室龙庆德副教授鉴定为兰科植物白及B. striata的干燥块茎。4-羟基苯基-葡萄糖苷（4-hydroxymethylphenyl β-D-glucoside）；4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯（blestroside）；1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯-2-葡萄糖苷（dactylorhin A）；1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯（militarine）；二氢菲5（dihydrophenanthrene 5）；1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯-2-[4-O-肉桂酰基]葡萄糖苷（gymnoside V）；二氢菲1（dihydrophenanthrene 1）；苄基氢菲3（benzylphenanthrene 3）和1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯-2-[4-O-肉桂酰基-6-O-乙酰基]葡萄糖苷（gymnoside Ⅸ）由本实验室从白及药材中分离得到，经1H，13 C-NMR，MS，UV和 IR鉴定，TLC纯度检查显示单一斑点，UPLC-PDA在多个波长检测，峰面积归一化含量均大于98%；乙腈（色谱纯，美国TEDIA有限公司，批号AS1122-001），甲酸（美国TEDIA有限公司，批号FS0630-020），甲醇（分析，上海振兴化工一厂，批号200909061），纯净水（广州屈臣氏食品饮料有限公司，批号20120722）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

ACQUITY BEH C18色谱柱（2.1 mm× 150 mm， 1.7 μm）；流动相乙腈（A）-水（B）；流速0.3 mL・min-1；梯度洗脱（0～10 min，5%～16% A；10～24 min，16%～30% A；24～27 min，30%A；27～32 min，31% A；32～33 min，31%～37% A；33～45 min，37%～55% A；45～46 min，55%～100% A）；柱温为45 ℃，阵列二极管检测器（PDA），检测波长280 nm，进样量2 μL。

2.2 供试品溶液的制备

白及药材经60 ℃干燥，粉碎过40目筛，取约1 g，精密称定，置烧瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定质量，水浴加热回流提取2 h，放置室温，用50%甲醇补足失重，摇匀，滤过，1万 r・min-1离心10 min，即得。

2.3 混合对照品溶液的制备

分别取9种对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，摇匀，配制成质量浓度分别为0.877 6，0.420 8，0.856 5，4.128，0.088 72，0.159，0.050 72，0.091 36，0.238 g・L-1的混合对照品储备液。

2.4 专属性试验

精密量取混合对照品储备液1 mL置5 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，得混合对照品溶液，分别吸取混合照品溶液和药材供试品溶液各2 μL，在上述色谱条件下测定，9种被测定成分分离良好，药材供试品溶液色谱中被测定的化合物与其他化合物色谱峰分良好，见图1，供试品中被测定化合物的保留时间分别与9个对照品的保留时间一致，供试品色谱中，与对照品色谱保留时间相同色谱峰的紫外光谱图一致，说明该方法具有良好的专属性。

2.5 线性关系试验

精密量取上述混合对照品储备液5 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，得混合对照品溶液①，精密吸取①5 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液②，精密吸取②5 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液③，如此逐级稀释，制备6个浓度的混合对照品溶液。

分别吸取6个浓度的混合对照品溶液照拟定的色谱条件进样，测定，以进样浓度（g・L-1）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程，见表1。

2.6 精密度试验

取同一份供试品溶液，连续进样5次，结果被测定的9个指标成分峰面积平均值的RSD在0.40%～2.4%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一批号白及药材6份，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，按样品测试方法测定，9个指标成分的平均含量分别为8.325，1.111，6.501，31.42，0.521 6，3.885，0.340 4，0.385 6，5.047 mg・g-1，RSD在1.8%～3.0%，表明该方法重复性良好。

2.8 中间精密度试验

于另一工作日，由另一名实验人员取与重复性同一批号的供试品6份，对其进行测定，9个指标成分的平均质量分数分别为8.384，1.069，6.452，31.96，0.530 2，3.916，0.334 2，0.391 5，4.969 mg・g-1，RSD在2.1%～3.3%，结果显示方法中间精密度良好。

2.9 耐用性试验

2.9.1 稳定性试验 取同一供试品溶液，按上述色谱条件，分别于0，2，4，6，8，12 h进样测定，结果显示9个指标成分平均峰面积的RSD在0.50%～2.6%，表明该溶液在12 h稳定。

2.9.2 不同色谱柱比较 取同一供试品溶液3份，按上述色谱条件，分别用3支不同批号的ACQUITY BEH C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）分析，3支色谱柱分离效果一致，9个指标成分用测定的平均含量的RSD在1.6%～3.1%。

2.10 加样回收率试验

取已测定含量的白及药材6份，每份约0.5 g，精密称定，精密加入9种被测定的化合物适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，按样品测试方法测定，计算回收率，9个指标成分的加样回收率在98.15%～102.2%，RSD在2.1%～3.6%，表明方法的准确度良好，见表2。

3 样品测定

分别取野生和人工栽培白及药材样品各6批，按2.2项下方法平行制备2份供试品溶液，按样品测试方法测定，记录峰面积，按外标法计算各批样品中各成分的含量平均值，见表3。

4 讨论

以不同浓度的甲醇为提取溶剂分别考察了加热回流提取和超声提取（250 W，23～29 kHz）的方法，并分别考察了提取时间，结果以50%甲醇加热回流提取2 h时，所测定的成分提取较为完全。

由于9种被测定化合物的紫外最大吸收波长均不相同，通过阵列二极管检测器得到的各化合物光谱图可知在280 nm均有吸收，在药材供试品色谱中基本能兼顾各成分色谱峰的丰度，因此选择280 nm为检测波长。

中药具有多成分、多靶点协同作用的特点，通过建立多指标成分的含量测定方法，实现对多个指标成分的控制，有助于将中药制剂工艺过程的控制直接在质量标准中得到体现[10]。本文建立了UPLC-PDA同时测定白及药材中9个指标成分含量的方法，经方法学验证具有灵敏度高、重复性好、快速、准确的优点，并运用该方法测定野生和人工栽培的白及药材中以上指标成分的含量，结果表明该方法适用于控制白及药材的质量，为完善和丰富白及药材质量标准提供了科学依据。

[参考文献]

[1] 中国药典. 一部[S]. 2010：95.

[2] 李伟平，何良艳，丁志山. 白及的应用及资源现状[J]. 中华中医药学刊，2012，30（1）： 158.

[3] 中国药典. 第二增补本[S]. 2013：91.

[4] 何迅，王爱民，李勇军，等. HPLC测定白及中militarine含量[J]. 中国中药杂志，2009，34（16）：2076.

[5] 王爱民，王永林，郑林，等. 白及药材中多糖的含量测定[J]. 中国中药杂志，2009，34（22）：2963.

[6] 王爱民，兰燕宇，黄勇，等. 紫金透骨喷雾剂中双[4-（β-D-吡喃葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯含量测定[J]. 贵阳医学院学报，2010，36（6）：564.

[7] 任华忠，何毓敏，杨丽. 白及化学成分其药理活性研究进展[J]. 亚太传统医药，2009，5（2）： 134.

[8] 韩广轩，王立新，张卫东，等. 中药白及的化学成分研究（Ⅱ）[J].第二军医大学学报，2002，23（9）： 1029.

[9] 任华忠，何毓敏，杨丽.白及化学成分其药理活性研究进展[J].亚太传统医药，2009，5（2）： 134.

[10] 周云凯，李伟平，田莎莎，等. 白及须根和块茎总酚含量的测定[J]. 中国实验方剂学杂志，2012，18（10）：161.

[11] 麻秀萍，杨清秋，蒋朝晖，等. 高效液相色谱法测定白及中肉桂酸[J]. 中成药，2011，33（9）：1631.

[12] 韩广轩，黄尊动，王麦莉，等. 8种产地白及中两种菲类的含量比较[J]. 中国药师，2011，14（12）：1744.

Simultaneous determination of nine chemical markers of

Bletillae Rhizoma by ultra performance liquid chromatography

WANG Ai-min， YAN Yan， LAN Bo， LIAO Shang-gao， WANG Yong-lin， LI Yong-jun

（1.Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM （Ministry of Education），

School of Pharmacy， Guiyang Medical College， Guiyang 550004， China；

2. Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics， Guiyang Medical College， Guiyang 550004， China；

3. Department of Pharmacy， Guizhou Provincial People′s Hospital， Guiyang 550001， China）

[Abstract] A UPLC method has been developed in the current investigation for simultaneous determination of nine chemical markers of Bletilla striata，4-hydroxymethylphenyl β-D-glucoside，blestroside，dactylorhin A，militarine，dihydrophenanthrene 5， gymnoside V，dihydrophenanthrene 1，benzylphenanthrene 3 and gymnosides Ⅸ. Separation was performed at 45 ℃ on an ACQUITY UPLC BEH C18 column （2.1 mm×150 mm， 1.7 μm） with a gradient solvent system of acetonitrile-water as the mobile phase. The flow rate was 0.3 mL・min-1， the detection wavelength was 280 nm. The results showed that the nine chemical markers could be well resolved and that in the selected linear range， all calibration curves of the nine chemical markers showed good linearity （r≥0.999 3）. The recoveries （n=6） were in the range of 98.15%～102.2% and RSDs were between 2.1%～3.6%. The data suggested that the developed UPLC-UV method had good reproducibility， robustness， and accuracy， which was suitable for the quality control of Bletilla striata. Applications of the method showed that the nine chemical markers had higher contents in the wild B. striata than in the cultivated ones.

[Key words] Bletillae Rhizoma； multiple chemical markers； ultra performance liquid chromatography

doi：10.4268/cjcmm20141121