一例转基因克隆水牛主要脏器组织结构观察

摘要：应用石蜡切片及HE染色技术观察转基因克隆水牛牛犊的心脏、肝、肾、胰腺、等主要脏器组织结构，并使用激光共聚焦显微镜对其心脏、肝、肾、冰冻组织切片进行荧光观察。结果表明，转基因克隆水牛心脏结构异常，心肌纤维间隙过大，闰盘结构不明显，出现炎症、出血等病理现象；肝、肾、胰腺、结构完整，细胞形态、分布均正常。激光共聚焦显微镜下各冰冻组织切片中均可见较均匀绿色荧光，初步证实绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）基因成功整合到了水牛体内。

关键词：水牛；转基因克隆；脏器；组织结构

中图分类号：S814.8 文献标识码： A 文章编号：0439-8114（2013）21-5251-02

Observation of Main Visceral Organ Structure in one Transgenic Cloned Buffalo

LU Jun-qiu，HU Wei-kun，ZHOU Yue，WANG Xiao-li

（College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning 530005， China）

Abstract： The main visceral organs such as heart，

转基因动物克隆技术是20世纪中后期兴起的一项技术。近年来，随着转基因动物研究的发展和深入，该技术被广泛应用于生物学、免疫学、生物制药及畜牧育种等领域[1，2]。

2010年初，广西大学动物科学技术学院的科研人员将一只3月龄的水牛胎儿的成纤维细胞经体外传代培养后，把含标记基因[绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）]和筛选基因的转基因载体导入，构建得到转基因克隆重构胚，并于2010年2月5日植入一头2岁半的母牛子宫内。同年12月19日顺利产下一对雄性双胞胎。其中一头体重为20.5 kg，正常存活；另一头体重为14 kg，夭折，无法凭外部观察判断死因。对夭折牛犊用紫外灯照射，可见头部和四肢明显表达绿色荧光蛋白基因[3]。

本试验试图通过组织冰冻切片和荧光显微观察技术查证外源基因是否成功转入水牛的内部组织器官；并通过石蜡切片和HE染色技术对转基因克隆水牛主要脏器组织结构进行观察分析，为探查犊牛死亡原因提供理论依据，也为今后转基因克隆水牛的研究提供必要的理论基础。

1 材料与方法

心脏、肝、肾、胰腺、组织取材于广西大学动物科学技术学院的转基因克隆水牛。所取以上部分器官组织用75%的乙醇固定，经脱水、透明、石蜡包埋后切片（厚度约7 μm），HE染色[4，5]，显微镜下观察、摄片。其余心脏、肝、肾、组织于包埋剂中在冷冻台上迅速冷冻固定，切片（厚度5～10 μm），激光共聚焦显微镜下进行观察、摄片[6]。

2 结果与分析

2.1 转基因克隆水牛组织HE染色切片观察

在4×10倍光镜下，对转基因克隆水牛心肌膜组织切片观察，可见心肌膜内的心肌纤维间隔多且宽；心肌纤维间隔中分布大量结缔组织（图1）。10×10倍光镜下，可见心脏横纹肌不明显，闰盘结构不明显，心肌纤维间可见破裂的血管，在其周围分布大量细胞群（图2）。40×10倍光镜下，可见心肌间有大量血细胞、巨噬细胞及少量淋巴细胞（图3）。转基因克隆水牛肝、肾、胰腺、的HE染色组织切片分别在4×10倍、10×10倍、40×10倍光镜下观察，组织结构清晰完整，细胞形态分布正常，没有病理异常现象。

2.2 转基因克隆水牛组织冰冻切片观察

在激光共聚焦显微镜下，用波长为488 nm的光波透射过冰冻切片，可观察到心脏、肝、肾、组织冰冻切片均呈现一片较为均匀的绿色荧光（图4）。

3 小结与讨论

在转基因动物工程中，常用绿色荧光蛋白基因与外源DNA相融合，再将外源基因导入动物体，从而便于对基因转入结果进行检测。若转入动物体内各组织器官产生绿色荧光，且荧光颜色均匀，说明外源基因整合成功；若转入动物体内只有少部分组织器官或某个部位产生绿色荧光，说明外源基因整合不理想或不成功[7]。本试验中在激光共聚焦显微镜下，转基因克隆水牛的心脏、肝、肾、组织冰冻切片均呈现出一片绿色荧光，因此可初步判断GFP基因已成功整合进该头水牛的内部组织中。

正常繁殖方式出生牛的心肌膜内的心肌纤维成螺旋状排列，多集合成束，心肌纤维之间较紧密并有闰盘特殊连接[8]。转基因克隆水牛的心肌纤维出现肌纤维间隙过大、闰盘结构不明显等异变，表明该水牛心脏结构异常；心肌膜还出现出血和发炎症状，这些症状都影响了心脏的收缩力度，导致心功能降低。同时，对该转基因克隆水牛的肝、肾、胰腺、组织HE染色切片观察表明，其结构形态均和正常繁殖方式出生的水牛类似，功能正常。因此，可初步判断该转基因克隆牛犊夭折可能是由于心脏功能下降引起的。

参考文献：

[1] 崔文涛.转基因牛研究进展[J].中国畜牧兽医，2007，34（7）：47-50.

[2] 张 贺，王承利.转基因动物研究进展[J]. 动物医学进展，2008（7）：59-62.

[3] 陆月玲.世界首例转基因克隆水牛在邕问世[N].南国今报，2010-12-20.

[4] 芮菊生.组织切片技术[M]. 北京：人民教育出版社，1980.

[5] 王 平.组织学实验指导[M].北京：北京大学出版社，1981.

[6] 孟运莲，付承英.组织学与胚胎学实验指导（双语）[M].武汉：湖北科学技术出版社，2006.

[7] 王燕容，何仲义.形态学实用技术[M]. 上海：第二军医大学出版社，2010.

[8] 沈霞芬.家畜组织学与胚胎学[M]. 北京：中国农业出版社，2000.