青蒿琥酯对膀胱癌T―24细胞生长的影响

摘要：目的 探讨青蒿琥酯（artesunate，Art）对人膀胱癌T-24细胞的抑制作用及机制。方法 用不同浓度的Art干预人膀胱癌T-24细胞，采用MTT法检测用药后细胞增殖的改变；划痕实验检测鱼藤素对细胞迁移能力的影响；流式细胞术（FCM）检测细胞周期的改变和凋亡率。结果 与对照组比较，Art可显著抑制人膀胱癌T-24细胞株增殖（P

关键词：膀胱癌；T-24细胞；青蒿琥酯；凋亡；细胞周期

膀胱癌是泌尿外科最常见的肿瘤，现仍以手术治疗为主，辅以化疗以及免疫治疗等其他治疗方法，其中化疗在其中起着关键的作用，但疗效不是很显著，治疗指数低，且副反应较大[1]，因此寻找新的、疗效显著的药物迫在眉睫。青蒿琥酯（artesunate，Art）是我国传统中药自主知识产权药品，但近期研究发现青蒿素及其衍生物对多种肿瘤细胞均有一定的抑制效应，显示出非常好的疗效[2-6]。但其对膀胱癌的抑制作用尚未见相关报道。因此，本实验通过观察Art对人膀胱癌T-24细胞的抑制作用，并初步探讨其可能的作用机制，为Art下一步临床应用提供相应的临床理论依据。

1资料与方法

1.1一般资料 人膀胱癌T-24细胞由华中科技大学同济医学院惠赠；DMEM培养基为美国Gibco公司产品；优级胎牛血清为杭州四季青生物工程有限公司产品； MTT为美国Sigma公司产品； Art注射液为桂林南药股份有限公司（批号030801）产品；磷脂结合蛋白（Annexin V，LBMs306BB）以及碘化丙啶（PI）为美国Caltag公司产品。流式细胞仪为美国Beckman coulter公司产品；酶标仪为美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 人膀胱癌T-24细胞培养于10%胎牛血清的DMEM培养基（含100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素）中，于37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养，用0.25%的胰酶进行消化传代，取对数生长期的细胞进行相关实验。

1.2.2细胞增殖抑制试验（MTT法） 将人膀胱癌T-24细胞以每孔5×103个细胞数接种于96孔培养板中，每孔培养液200 μL。分组为：对照组、药物组（使Art终浓度为10、40、60 μmol/L）；待细胞贴壁生长后，药物组细胞分别加入相应浓度的Art，对照组中加入等体积培养液，每组均设3个复孔，置于370C，5% CO2条件下培养箱中分别孵育24、48、72 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL） 20 μl，再次置于细胞培养箱中继续培养4 h后终止培养，弃掉培养液，每孔加入150 μl DMSO，充分振荡10 min，使结晶充分溶解。选择490 nm波长，在酶标仪上测定各孔光密度值OD490，实验重复3次。按下列公式计算细胞抑制率：细胞抑制率（%）=（对照组D490值-用药组D490值）/对照组D490值×100%。

1.2.3划痕实验检测Art对T-24迁移能力的影响 将T-24细胞接种于6孔细胞培养板中，使细胞密度为2×105个细胞/孔，分组为：对照组、Art组（40、60 μmol/L），将细胞进行培养24 h后，用10 μL枪头于细胞层中划一直线，形成宽度均匀一致的细胞伤口模型，每孔划3条伤痕，用PBS洗掉悬浮的细胞后，再加入相应浓度药物，而对照组中加入等体积培养液，分别在培育0、24、48 h时，于光学显微镜（×100）下观察并测量划痕的宽度，分别计算3条平行划痕的平均距离（每条划痕各取3个固定位置计算距离），实验重复3次。细胞迁移能力以迁移率表示： 迁移率=（原划痕宽度-现划痕宽度）/原划痕宽度。

1.2.4流式细胞仪（FCM）测定Art对T-24细胞周期以及凋亡的影响 取处于数生长期的人膀胱癌T-24细胞，消化传代后，重新接种于培养瓶，使其密度为5×105/ml；分组为：对照组、药物组（使Art终浓度为10、40、60 μmol/L）；待细胞贴壁后，药物组细胞分别加入相应浓度的Art，对照组加入等体积培养液，培养48 h后收集细胞，用70%冷乙醇分散固定细胞，4℃过夜。取固定好的细胞加PBS洗涤一次，离心弃上清，然后加入50 μg/ml的RNase 1 ml置于37℃水浴锅中30 min，离心去上清，加入60 μg/ml的PI 1 ml，避光孵育30 min，经尼龙网过滤，上机进行检测，用流式细胞仪进行细胞周期以及凋亡分析。

1.3统计学分析 应用统计学软件SPSS 13.0进行统计学分析，数据用x±s 表示，同一浓度各处理组间采用单因素方差分析进行比较，组间两两比较采用t检验，P

2结果

2.1 Art对膀胱癌T-24细胞增殖的影响 MTT实验结果显示：药物组各个浓度均可显著抑制膀胱癌T-24细胞的增殖，而且Art对膀胱癌T-24细胞的抑制作用随着浓度的增加及作用时间的延长而递增，呈现明显的时效、量效关系，各实验组与对照组比较，差异具有统计学意义（P

2.2 Art抑制膀胱癌T-24细胞的迁移 细胞划痕实验结果显示，40 μmol/L、60 μmol/L的 Art作用T-24细胞24 h、48 h后的划痕宽度均大于对照组，计算各组细胞的迁移率发现，Art作用细胞24 h、48 h后，其迁移率均与对照组相比较，差异有统计学意义（P

2.3 Art对膀胱癌T-24细胞周期以及凋亡的影响 流式细胞术结果显示，对照组中T-24细胞处于S期的比例最高，表明肿瘤细胞生长旺盛，而各浓度药物组均可使S期、G2/M比例降低，使G0/G1比例增加，与对照组比较，差异具有统计学意义（P

3讨论

2010年美国癌症学会最新统计调查发现，膀胱癌的发病率在男性占全身肿瘤的第四位。死亡率占全身肿瘤的第九位[7]。目前针对膀胱癌的治疗主要是手术联合化疗，但疗效都不显著，且化疗副作用较多，限制了许多药物的应用，故寻找新的、疗效显著及副作用少的药物是非常有必要的。

而植物制剂治疗肿瘤具有副作用小，疗效可靠等优点，显示出非常好的前景。因此，从中草药等植物药中筛选提取治疗膀胱癌的新药是目前研究的重点与热点之一[8]。青蒿素是由我国科学家研究发现并从黄花蒿中提取的抗疟疾新药。近期有研究发现[9]Art有明显的抑制鼠H22肝癌细胞的作用，另外有研究发现[10] Art可显著抑制正常人脐静脉内皮细胞以及肾移植后的Kaposi's肉瘤KS-IMM细胞。由此可见，Art具有很好的抗肿瘤作用。

我们通过MTT法检测发现Art各浓度组可显著抑制T-24细胞的增殖，且Art对T-24细胞的抑制效应随着药物浓度增加及作用时间延长而具有递增趋势，具有明显的时效、量效关系；细胞划痕试验结果显示Art可抑制其迁移；FCM分析结果显示不同浓度Art可使S期细胞明显减少，G0/G1期比例增加，G2/M期无明显变化，表明 Art通过阻滞T-24细胞进入S期而发挥抑制生长的作用，且Art能够促进T-24细胞的凋亡。这与其他学者研究发现[11-12]Art可将 P388细胞、L1210细胞阻滞于G1期以及诱导其凋亡的结果相一致。

综上所述，Art可显著抑制膀胱癌T-24细胞的增殖，降低其迁移，其机制可能与阻止细胞周期以及诱导细胞凋亡相关，但具体作用机制还有待更进一步研究，本实验为Art用于膀胱癌的治疗提供了一定的理论依据。

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