有菌条件下月季组织培养技术

摘要介绍有菌环境条件下月季组织培养技术，包括培养基组成、培养瓶灭菌、灭菌培养基的制作、取材、材料处理、接种、培养、继代增值培养、生根培养、炼苗等方面内容，以为月季无性繁殖提供参考。

关键词月季；组织培养；有菌环境

中图分类号 S685.12 文献标识码B文章编号 1007-5739（2012）08-0216-01

月季属蔷薇科蔷薇属花卉，品种繁多，近100年来累计的品种数以万计，目前流行的有数千个品种，而且每年许多国家仍在不断选育新品种。现在许多国家都在用组织培养技术来繁殖月季的优良品种，目前这种快速繁殖方法技术成熟，已进行工厂化生产，对加速老品种的更新换代，迅速普及月季名优新特品种将起到重要的作用。月季常规组培技术报道很多，但在有菌环境条件下的月季组织培养技术未见报道。

1培养基组成

诱导萌芽培养基：MS+BA 0.5-1.0 mg/L+S106杀菌剂0.3 mL/L；增殖培养基：MS+BA 1-2 mg/L+NAA 0.1-0.2 mg/L+S106杀菌剂0.3 mL/L；生根培养基：1/2 MS+NAA 0.1-0.2 mg/L+IAA 1.0 mg/L（或NAA 0.5 mg/L） +S106杀菌剂0.3 mL/L。

2培养瓶灭菌

根据培养瓶的大小、数量，以浸没培养瓶及瓶盖为度，在水池或容器中量取适度的自来水，然后加入S105杀菌剂0.2 mL/L，搅拌均匀，放入洗净的培养瓶及盖浸泡2 h以上。然后捞取培养瓶及盖，将其倒扣在干净的工作台面上滤干水，待用。

3灭菌培养基的制作

以制取1 L培养基为例：量取1 L自来水放在电饭煲内加热（因加热蒸发加入母液后到分装时煮沸刚好是定容要求的1 100 mL，冷却后就是1 L，故配1 L培养基量取1 L自来水），称取白糖30 g、琼脂4 g，加入电饭煲锅水中，待全部溶解，再加入100倍MS母液（其中：大量元素A 10 mL、大量元素B 10 mL、铁盐10 mL、微量元素10 mL、有机物10 mL、1 mg/mL BA 0.5-1.0 mL），煮沸。用1 mol NaOH或HCl调pH值至 5.8，最后加入S106杀菌剂溶液0.3 mL，继续煮沸2-3 min使杀菌剂在培养基中混合均匀，再进行分装。

分装前拿起培养瓶使瓶口朝下用力甩净附着在瓶壁和瓶口的水珠，使瓶口朝上放在工作台面上，然后倒入培养基均匀分装，最后拿取培养瓶盖用力甩干瓶盖附着的水珠，扣在倒了培养基的瓶口上，待凝固接种。

4取材

在春季或秋季，连续的晴天上午露水干后，选取生长健壮的当年生半木质化、无病虫害的优良品种枝条带回实验室。除去枝条上的叶片和皮刺，切去枝条上端嫩茎和下端木质化的茎杆，选留中间半木质化、饱满未萌发的带腋芽茎段作外植体，切成长1 cm带腋芽的茎段[1-2]。

5材料处理

先用洗洁精少许滴入一个干净的瓶中，加入整理好的外植体茎段，加入占瓶体积2/3的自来水振荡洗涤5-6 min（也可把瓶子放在磁力搅拌器上搅动洗涤5-6 min），倒去瓶中带泡沫的水，找一块医用纱布扎住瓶口，放自来水龙头下，流水冲洗至无泡沫为止。

倒去自来水，把茎段转移到一个经S105杀菌液处理过的瓶中，倒入75%酒精浸泡8-10 s，倒入自来水，立即倒出瓶中水，再倒入自来水冲洗1次。倒出并滤干瓶中自来水，倒入0.1%升汞溶液振荡浸泡8-12 min（也可放在磁力搅拌器上搅拌浸泡8-12 min），时间从倒入升汞溶液至倒出升汞溶液加入自来水为止，加入自来水振荡洗涤每次不少于3 min，连续洗涤5-6次。

根据外植体数量，按100 mL凉开水加入S106杀菌剂0.5 mL的比例，制作外植体处理液。把外植体转移到此处理液中，处理液的体积为外植体的3-4倍，浸泡1.5-2.0 h（也可放在磁力搅拌器上搅拌浸泡1.5-2.0 h），待接种[3]。

6接种

镊子、剪刀经灭菌器灭菌或经酒精灼烧摊晾浸泡在75%酒精中，左手拿镊子，右手拿剪刀，用镊子从处理液中夹起外植体茎段，甩干附着在外植体上的处理液，用剪刀剪去带腋芽茎段两端接触杀菌处理液的断面，打开扣在培养基瓶盖按极性方向插入培养基，一瓶插1个茎段，扭紧瓶盖，把用过的剪刀、镊子重新浸泡在酒精瓶中。取出另一套剪刀、镊子重复操作直至全部接种完华。

7培养

把接种好的培养瓶用记号笔写上接种日期，转入培养室培养架上培养。培养室光照10～12 h/d，光强800～1 800 lx，温度20～23 ℃，最高24～26 ℃。培养20-25 d，当腋芽萌发至1-2 cm时，可进行继代增殖培养。在培养期间发现污染，应及时把污染瓶移出培养室。

8继代增殖培养

制作灭菌增殖培养基：以制取1 L培养基为例，量取1 L自来水放在电饭煲内加热，称取白糖30 g、琼脂4 g，加入电饭煲锅水中，待全部溶解再加入MS母液（大量元素A 10 mL、大量元素B 10 mL、铁盐10 mL、微量元素10 mL、有机物10 mL、1 mg/mL BA 2 mL，1 mg/mL NAA 0.2 mL）煮沸。用1 mol （下转第221页）

（上接第216页）

NaOH或HCl调pH值至5.8，最后加入S106杀菌剂溶液0.3 mL，继续煮沸2-3 min使杀菌剂在培养基中混合均匀，再进行分装。

分装前拿取培养瓶瓶口朝下用力甩净附着在瓶壁和瓶口的水珠，然后瓶口朝上放在工作台面上，然后倒出培养基均匀分装，最后拿取培养瓶盖用力甩干瓶盖附着的水珠，扣在倒了培养基的瓶口上，待凝固接种。

镊子、剪刀经灭菌器灭菌或经酒精灼烧摊晾浸泡在75%酒精中，左手拿镊子，右手拿剪刀，用镊子从培养瓶中夹起外植体萌芽茎段，用剪刀剪取萌芽，原茎段弃去不要。打开扣在培养基瓶盖按极性方向插入培养基，一瓶插4个芽或新茎剪成的带叶茎段，扭紧瓶盖，把用过的剪刀、镊子重新浸泡在酒精瓶中。取出另一套剪刀、镊子重复操作直至全部接种完华。把接种好的培养瓶用记号笔写上接种日期，转入堷养室培养架上堷养。培养室光照10～12 h/d，光强800～1 800 lx，温度20～23 ℃，最高24～26 ℃。培养20-25 d，待芽增多继续剪芽进行增殖，直到达到目标苗数，即可转入生根培养[4]。

9生根培养

制作灭菌生根培养基：以制取1 L培养基为例，量取1 L自来水放在电饭煲内加热，称取白糖15 g、琼脂4 g，加入电饭煲锅水中，待全部溶解再加入MS母液（大量元素A 5 mL、大量元素B 5 mL、铁盐10 mL、微量元素10 mL、有机物10 mL、1 mg/mL NAA 0.2 mL、1 mg/mL IAA 1 mL）煮沸。用1 mol NaOH或HCl调pH值至5.8，最后加入S106杀菌剂溶液0.3 mL，继续煮沸2-3 min使杀菌剂在培养基中混合均匀，再进行分装。

分装前拿取培养瓶瓶口朝下用力甩净附着在瓶壁和瓶口的水珠，然后瓶口朝上放在工作台面上，然后倒出培养基均匀分装，最后拿取培养瓶盖用力甩干瓶盖附着的水珠，扣在倒了培养基的瓶口上，待凝固接种。

镊子、剪刀经灭菌器灭菌或经酒精灼烧摊晾浸泡在75%酒精中，左手拿镊子，右手拿剪刀，用镊子从培养瓶中夹起月季丛生芽，用剪刀剪成单芽或带二叶茎段，打开培养基瓶盖按极性方向插入培养基，一瓶插10个芽或剪成的带二叶茎段，扭紧瓶盖，把用过的剪刀、镊子重新浸泡在酒精瓶中。取出另一套剪刀、镊子重复操作直至全部接种完毕。把接种好的培养瓶用记号笔写上接种日期，转入培养室培养架上培养。培养室光照10～12 h/d，光强800～1 800 1x，温度20～23 ℃，最高24～26 ℃。培养20-25 d，待全部长出根，苗高3 cm时即可出瓶移栽炼苗[5]。

10炼苗

生根移栽炼苗管理同常规组培苗移栽炼苗管理。

11参考文献

[1] 周艳，黄承玲，陆叶，等.切花月季卡罗拉组培与快繁研究——基本外植体和初代培养基筛选[J].种子，2011，30（11）：92-94.

[2] 张凌云，杨奕，邓赞.不同因子对月季愈伤组织诱导的影响[J].贵州农业科技，2011，39（10）：51-53，F2.

[3] 关健.浅谈月季组织培养技术研究[J].黑龙江科技信息，2011（25）：158，161.

[4] 张圣芸.月季组织培养繁殖技术[J].农村科技，2011（9）：48-49.

[5] 林小洁，李洪清.紫花月季组织培养与快速繁殖研究[J].安徽农业科学，2011，39（19）：11380-11381，11385.