MXC对小鼠离体培养卵巢颗粒细胞凋亡的影响

作者：王宝平，马向东，马佳佳，陈必良

【摘要】 目的： 研究 甲氧滴滴涕（mxc）对颗粒细胞凋亡的 影响 ，探讨mxc对雌性小鼠性腺毒性的作用机制. 方法 ：以孕马血清（pmsg）处理的雌性昆明小鼠为模型,制备颗粒细胞悬液,以不同浓度的mxc （1.25, 2.50，5.00和10.00 μg/ml）对其作用24，48 h后, 应用 tunel法及流式细胞术,检测mxc对离体培养颗粒细胞凋亡的影响. 结果：体外培养的颗粒细胞存在自发性凋亡，对照组和mxc不同浓度实验组的颗粒细胞都有不同程度的体积变小、细胞浓缩、变圆、离壁等类似凋亡的特征. mxc 1.25 μg/ml浓度组凋亡的颗粒细胞最少,其余3个实验组随mxc浓度的升高,凋亡细胞也逐渐增多, mxc 10.00 μg/ml浓度组的颗粒细胞凋亡数量显著高于对照组和其他各组(p<0.05). 采用3′?末端原位标记法在细胞中检测到棕色深染的凋亡颗粒细胞；流式细胞术 分析 结果显示处于早期凋亡的细胞所占百分率明显升高(最高达53.5%). 结论：环境污染物高浓度mxc可抑制除血清后体外培养的颗粒细胞生长,导致颗粒细胞凋亡,它的作用是双向的并具有剂量依赖性.

【关键词】 甲氧滴滴涕; 卵泡颗粒细胞; 细胞凋亡; 小鼠

【abstract】 aim: to investigate the relationship between female gonad toxicity of methoxychlor (mxc) on mouse and the apoptosis of granulosa cells. methods: pregnant mares? serum gonadotrophin (pmsg)?treated female kunming mice were used as models and granulosa cell suspensions were prepared. mxc (1.25, 2.50，5.00，10.00 μg/ml) was added to cultured cells after 24,48 h of incubation. the effect of mxc on apoptosis of granulosa cells was assessed by tunel method and flow cytometry. results: there was spontaneous apoptosis in the cultured granulosa cells and the apoptosis?like changes such as cell shrin?kage, condensed nuclei, rounded shape, droping?off wall existed in all control groups and experimental groups treated with mxc. in the mxc groups, the least apoptosis?like granulosa cells were found in 1.25 μg/ml group, and the number of apoptosis?like granulosa cells increased gradually in other 3 test groups with the increasing concentrations of mxc. the number of apoptosis?like granulosa cells was significantly higher in 10.00 μg/ml group than that in other groups (p<0.05). apoptotic signals were detected by dna 3′?end labeling method in granulosa cells of mouse. flow cytometry revealed the increasing proportion of early?stage apoptotic cells (the maximum was 53.5%). conclusion: a higher concentration of mxc may serve as an important endocrine disrupting chemical (edc), mediating mouse granulose cell apoptosis in vitro after fbs was removed from medium. the effect is bidirectional and concentration dependent.

【keywords】 methoxychlor; granulose cell; apoptosis; mouse

0 引言

甲氧滴滴涕(methoxychlor, mxc)是一种被人们主动投放于环境中的数量最大、毒性最广的化学物质，因其杀虫效果明显，被人们广泛应用于水果，蔬菜和园林中杀虫. 近年来，mxc的生殖毒性作用不断被发现［1］, 有研究表明长期接触mxc可导致生育能力下降［2-3］和异常胚胎细胞的形成［4］，但其生殖细胞的毒性作用机制仍不清楚，有关是否对卵泡颗粒细胞的生存具有影响的报道少见. 本研究以小鼠离体培养的颗粒细胞为模型，观察具有雌激素样作用的环境污染物mxc对颗粒细胞存活的影响，以探讨mxc的雌性生殖细胞毒性作用机制.

1 材料和方法

1．1 材料 健康，尚未性成熟的雌性昆明小鼠40只，体质量18～22 g（第四军医大学实验动物中心）；甲氧滴滴涕（批号：49054，美国sigma公司）；dmem/f12干粉细胞培养基，无脂肪酸牛血清白蛋白（bsa）（美国gibcol公司）；已二胺四乙酸（edta）、孕马血清(pmsg）（天津生物制品公司）；无ca2+,mg2+磷酸盐缓冲液（pbs）（北京中杉金桥公司）；3′?oh末端原位细胞凋亡检测试剂盒、多聚赖氨酸、dab显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；流式细胞仪（美国 epics公司）.

1．2 方法

1．2．1 小鼠颗粒细胞的制备及原代培养 参照 文献 ［5］的方法制备颗粒细胞，选取小鼠，皮下注射pmsg，10 u/只，饲养温度22℃，12 h光照，12 h黑暗，允许自由饮水和摄食. 48 h后颈椎脱臼处死，无菌条件下迅速取出双侧卵巢，用pbs（-）清洗3次，在体视显微镜下除去卵巢周围包膜及脂肪组织. 将卵巢置于dmem/f?12培养液中，37℃孵育15 min. 然后在解剖镜下用不锈钢针刺破排卵前卵泡使颗粒细胞和卵母细胞释放出来，加入1 g/l透明质酸酶消化使颗粒细胞与卵母细胞分离，过200目筛网， 1000 r/min 离心5 min. 弃去上清后，用dmem/f?12培养液（含0.5 g/l bsa；5 g/l蔗糖；6.8 mmol/l edta），垂悬细胞沉淀. 37℃ 50 ml/l co2孵箱中孵育15 min，然后用dmem/f?12培养液洗涤细胞3次，1000 r/min 离心5 min. 采用文献［6］的方法用台盼蓝排斥法检查活细胞比率（85%左右），细胞用一定量的无血清dmem/f?12培养基（含100 u/l青霉素；100 μg/ml链霉素；0.5 g/l bsa）稀释并用血细胞计数法计数，调整细胞密度，将细胞分别接种于两个250 ml无菌的培养瓶中. 置于37℃ 50 ml/l co2培养箱中预培养.

1．2．2 实验分组 将细胞分为对照组：含0.5 g/l bsa的dmed/f12细胞培养液和四个mxc不同浓度实验组（m1～m4组）： mxc含量分别为1.25, 2.50, 5.00，10.00 μg/ml,每组均设4个重复.

1．2．3 tunel法检测颗粒细胞凋亡 将颗粒细胞接种于铺有盖玻片的100 mm培养皿，孵育24 h后培养液换为不同终浓度的mxc应用液，分别于第12,24和48 h后收集颗粒细胞爬片，用40 g/l多聚甲醛固定1 h，置于新鲜配置30 ml/l h2o2中，室温处理10 min，然后加入标记缓冲液（labeling buffer）20 μl/片，以保持切片湿润. 置样品于湿盒中，37℃标记2 h. 加封闭液50 μl/片，室温30 min，甩掉封闭液，不洗. 加入tunel反应混合物，37℃湿盒中反应1 h，再加入稀释后的sabc 50 μl/片,37℃反应30 min. dab显色液显色，自来水冲洗，苏木素浅染，脱水，透明，封片（每次反应间隔均用tbs洗3次）. 阴性对照为在标记反应混合物中不加脱氧核糖核苷酸末端转移酶（tdt酶），其余操作步骤相同. 病理图像分析仪观察(阳性反应细胞核呈棕黄色, 颗粒清晰，定位准确；阴性反应细胞呈兰紫色),拍照,镜下随机计数10个视野细胞, 计算 阳性细胞数占总细胞数目的比例,求其均值即为卵巢细胞凋亡指数(apoptosis index, ai).

1．2．4 annexin v/pi双染流式细胞仪检测早期凋亡率 将250 ml培养瓶中的颗粒细胞以1×106个/瓶转接种于50 ml无菌的培养瓶中，孵育24 h后培养液换为不同终浓度的mxc应用液，24，48 h后收集卵巢颗粒细胞，将培养瓶中的原培养液弃去,加入少量的2.5 g/l胰酶,清洗后弃去;再加入适量的2.5 g/l胰酶,在倒置显微镜下观察,见细胞稍变圆时,立即竖起培养瓶,停止胰酶作用,弃去胰酶;每孔各加入1 ml的磷酸盐缓冲液(pbs),用吸管反复吹打,直至细胞成单细胞悬液为止,移入离心管中，1000 r/min离心5 min，弃上清液. 用4℃预冷过的750 ml/l乙醇固定,4℃保存,至少固定18 h,用时1000 r/min 离心5 min,弃去无水乙醇，用pbs洗细胞2次后，调整细胞浓度为1×106/ml,取1 ml细胞悬液,用pbs洗3次之后,参照文献［7］的方法采用annexin v?fitc及pi染色后上机操作,以未染色细胞将机器调零，以annexin v?fitc单染管和pi单染管作基准参照，选取散点图作直观显示，即可对细胞早期凋亡进行检测,并利用mcyclf软件对细胞凋亡率进行分析.

统计学处理：实验结果用x±s表示,所有数据采用spss 11.0统计软件进行单因素方差 分析 （one?way anova）及lds?t检验， p<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2．1 tunel法检测颗粒细胞凋亡结果 于转染后12, 24及48 h tunel法染色结果显示：体外培养的颗粒细胞存在自发性凋亡，随着mxc浓度的增高和作用时间的延长，颗粒细胞的存活数下降，在作用12 h后细胞基本上存活，处理24 h后细胞开始出现凋亡，至48 h后凋亡达到高峰. 各实验组中，mxc 10.00 μg/ml浓度组凋亡最显著，mxc 5.00 μg/ml浓度组次之，其次是mxc 2.50 μg/ml浓度组；mxc 1.25 μg/ml浓度组与对照组未见明显阳性凋亡细胞. ai:对照组为（9.8±2.2）%，mxc 1.25 μg/ml浓度组为（10.8±2.4）%，mxc 2.50 μg/ml浓度组为（23.4±3.6）%，mxc 5.00 μg/ml浓度组为（28.3±4.6）%，mxc 10.00 μg/ml浓度组为（40.5±4.3）%. 经t检验, 对照组与1.25 μg/ml浓度组比较，差异无统计学意义(p>0.05)；对照组与2.50, 5.00, 10.00 μg/ml各浓度组比较, 差异均具有统计学意义(p<0.01). 提示mxc可显著促进小鼠离体培养颗粒细胞的凋亡（p<0.01，图1）.

a：对照组；b：mxc2.50 μg/ml浓度组；c：mxc 5.00 μg/ml浓度组；d：mxc 10.00 μg/ml浓度组.

图1 转染不同剂量mxc的小鼠卵巢颗粒细胞的凋亡检测结果 dab ×400（略）

2.2 annexin v/pi双染流式细胞仪分析 在mxc 2.50 μg/ml浓度作用卵巢颗粒细胞24 h后即可明显诱导颗粒细胞的早期凋亡，这种效应随mxc剂量增加和作用时间的延长而明显增强（p<0.01,表1）.

表1 不同浓度mxc作用小鼠卵巢颗粒细胞后annexin v/pi检测早期凋亡（略）

bp<0.01 vs对照.

3 讨论

大量 研究 表明，mxc具有拟内源性性激素的作用，即使是微量的mxc也可对正常的激素作用产生 影响 （主要对女性激素）. 目前 关于mxc的毒性作用仅限于动物体内实验大体的研究，但具体是通过那条分子途径，破坏那些细胞的功能，影响那些激素水平的表达而发挥其毒性作用的，mxc是否对卵巢颗粒细胞的存活有较大的影响等的机理仍未阐明，因此，预防和 治疗 仍缺乏 科学 依据. 针对这些 问题 展开mxc对体外原代培养卵巢颗粒细胞毒性的研究，具有重要的现实意义.

我们采用不同浓度mxc作用于原代培养卵巢颗粒细胞24，48 h，在细胞发生凋亡时，由于内源性钙?镁离子依赖性核酸内切酶被激活，选择性降解核小体间dna，核小体内dna断裂出现缺口，即产生大量的黏性3′?oh末端,用缺口末端标记法标记，加入dab显色后在原位出现棕色沉淀，从而可以在显微镜下观察到被着色的凋亡细胞. 此法灵敏度高，被广泛用于检测细胞凋亡. 此外，细胞发生凋亡时细胞膜成分亦发生改变. 在凋亡早期，原来位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine,ps）迁移至脂双层外侧，ps外翻是凋亡细胞的早期事件. annexin v是一种ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与ps高亲和力特异性结合. 与pi双染细胞通过流式细胞仪可区分活细胞、凋亡细胞及坏死细胞. 两项指标检测的结果均表明mxc能够诱导小鼠卵巢颗粒细胞的凋亡，但对细胞坏死没有影响. 并且mxc的促颗粒细胞凋亡的效应随着其浓度和时间的增加而增强,这结果与相关体内实验类似［8］.

原代培养卵巢颗粒细胞 应用 于药物生殖毒性性研究是目前一个比较新的 方法 ,本实验采用了细胞体外实验来研究mxc可能的促凋亡作用,采用在培养液中直接加入mxc，发现在2.50～10.00 μg/ml给药浓度下,mxc对体外培养卵巢颗粒细胞有明显的促凋亡作用. 由于国内外相关报道很少,mxc的生殖系统毒性还有待于结合其他细胞实验或动物实验来进行深入的研究.

【 参考 文献 】

［1］ kim hs, kang ts, kang ih, et al. validation study of oecd rodent uterotrophic assay for the assessment of estrogenic activity in sprague?dawley immature female rats ［j］. toxicol environ health a, 2005, 68(23?24): 2249-2262.

［2］ fisk at, stern ga, hobson ka, et al. persistent organic pollutants (pops) in a small, herbivorous, arctic marine zooplankton (calanus hyperboreus): trends from april to july and influence of lipids and trophic transfer［j］.mar pollut bull, 2001，43(1?6):93-101.

［3］ 王晓蓉，陈必良.内分泌干扰物mxc对生殖和胚胎发育的影响［j］.