禽类防御素分子生物学研究进展

摘要:禽类防御素是广泛存在于禽类体内的一类抗菌肽，具有抗微生物和调节免疫等多种生物学功能。禽类防御素的抗菌谱广，作用机理独特，不易产生耐药性，因此在新药研发领域具有潜在的开发价值。本文就禽类防御素在基因进化、组织分布和生物学活性方面的研究进展进行综述。

关键词:禽类防御素;分子生物学;进化;活性

中图分类号:S83 文献标志码:A 文章编号:0529－5130(2016)01－0136－04

禽类防御素是一类内源性阳离子抗菌肽，在禽类先天性免疫系统中发挥着重要作用。禽类防御素具有广谱抗细菌、真菌和某些病毒的活性，是禽类抵抗外来致病性微生物侵袭的重要武器。据推测，由于禽类的异嗜性白细胞缺乏氧化机制，禽类可能更多依赖于防御素等抗菌肽类物质来抵御感染［1］。目前，科研工作者们已从多种家禽和野禽体内发现了数十种防御素或其基因，并对部分禽类防御素的分子结构、抗菌活性、抗病毒活性和组织表达特性等进行了研究［2］。体外研究发现，除了抗微生物活性，某些禽类防御素还参与免疫调节和生殖活动。近些年，国内外对禽类防御素的研究报道不断增多，下面对其分子生物学方面的研究进展做一综述。

1禽类防御素的分子结构

从分子结构划分，目前已发现的所有禽类防御素均属于β－防御素。因此，禽类防御素又被称为禽β－防御素(avianbetadefensins，AvBDs)。AvBDs的前体由一个分泌型的信号肽和成熟肽构成，许多AvBDs前体还有一个短的前片段(propiece)。前片段连接信号肽和成熟肽，通常被认为起到抑制防御素的活性，防止其伤害宿主细胞的作用。少数AvBDs，例如鸡AvBD3和AvBD11，在成熟肽的C末端还有一个后片段(post－piece)。后片段的作用尚不十分清楚。通过分析鸡AvBD11的后片段发现其有3对二硫键结构，因此人们推测鸡AvBD11的后片段可能是基因复制过程中出现的多拷贝［3］。AvBDs的成熟肽部分是最终发挥生物学功能的成熟分子，通常由38～46个氨基酸构成，大小为3～4ku。成熟肽具有β－折叠和α－螺旋结构，分子内有6对半胱氨酸形成的3对二硫键。二硫键对保证AvBDs的正确折叠和维持空间构象具有重要作用。

2禽类防御素的基因进化

研究发现，哺乳动物的α－防御素基因簇位于β－防御素基因簇中，而少数灵长类特有的θ－防御素基因位于α－防御素基因中［4］。这暗示α－防御素基因由β－防御素基因进化而来，而θ－防御素基因又由α－防御素基因进化而来。3种动物防御素中，只有β－防御素是所有脊椎动物所共有的，从低等的鱼类到高等的哺乳类动物都发现有β－防御素，而且β－防御素的氨基酸序列和结构更接近于昆虫等低等生物的防御素。进化树分析也发现，禽类防御素与哺乳动物β－防御素的进化关系近。这些研究表明，禽类和哺乳类动物的防御素基因可能源自于它们共同的远古基因。禽类的基因组中有多个AvBD基因。根据鸡的基因组测序结果，人们发现鸡有14种防御素(Gal－1～Gal－14)，并通过生物信息学技术确定了这些防御素的基因序列。这14种防御素基因均位于3号染色体的末端，且成簇存在［5］。在其他禽类体内也发现了多种AvBD基因。进化树分析表明，AvBD基因在鸟类分化前就已经在进化。禽类有许多同源AvBD基因，但有些AvBD基因也显示出了一定的物种特异性，例如AvBD14目前只发现于鸡。基于进化树的分析显示AvBD14可能由AvBD13的一个重复拷贝进化而来。随着斑胸草雀(zebrafinch)基因组测序的完成，人们对比分析了鸡和斑胸草雀的β－防御素基因。基因组测序显示斑胸草雀有22个β－防御素基因，其中的10个能在鸡的基因组中找到同源基因，另外的12个基因可能由AvBD1或AvBD3演变而来，例如AvBD123和AvBD118［2］。多个防御素基因的存在可能对提高禽类的免疫防御能力具有帮助。对其他已发现的禽类(例如鸭、鹅、鹌鹑、鸽等)的防御素基因进行分析也发现，同类禽防御素基因的同源性较高，但不同物种间仍有明显差异，特别是防御素的成熟肽部分变化较大。和哺乳动物的防御素一样，禽类防御素的成熟肽很可能在正向选择(positiveselec-tion)压力下发生进化［6］。在正向选择压力下，成熟肽的某些氨基酸变位点发生改变，生物学活性也随之变化。

3禽类防御素的组织分布与表达调控

和动物防御素一样，禽类防御素主要来自骨髓源细胞或上皮细胞。例如鸡AvBD1，2和4－7在骨髓源细胞中表达，而AvBD8－14主要由各种上皮细胞表达，当然其他一些组织细胞也具有表达防御素的能力［7］。AvBDs在不同组织中的表达量不同。AvBD1，2，6和7在骨髓中表达量较高;AvBD1，2，6在法氏囊中表达量较高;AvBD13在脾脏中表达量较高。AvBD2在异嗜细胞中高表达;AvBD1，2，6，10在呼吸道中表达量较高;AvBD9－12在肾脏中大量表达［3，8］。在禽类的生殖器官中也有防御素的大量表达，例如鸡AvBD1，2，4，6在组织中高表达，可能暗示这些防御素与生殖活动有关。某些人类β－防御素(例如DEFB126)被证实与生成有关［9］，是否禽类防御素也具有类似的功能还有待进一步研究。除了组织差异外，禽类防御素的表达量也有种属差异。例如有研究表明，AvBD10在鹌鹑骨髓中高表达，而在鸡骨髓中没有发现高表达［10］。目前的研究表明，禽类防御素的表达受动物生长、感染、日粮成分和炎症反应等多种因素的调控。AvBD7在母鸡的生长过程中表达量逐渐增加直至性成熟，而AvBD14的表达则恰恰相反［11］。在鸡性成熟后，多数AvBDs在附睾、阴道等处表达量升高［12］。蛋鸡生殖道中防御素的表达受LPS和白介素的影响［13］。鸭感染鸭肝炎病毒后，肝脏中AvBD7的表达量上调，而AvBD12在多个器官中的表达量则下调［14］。日粮中维生素D3的含量能影响鸡AvBD1的表达［2］;饲料中添加丁酸盐能提高多数鸡AvBDs的表达水平［15］。

4禽类防御素的生物学活性

4.1抗微生物活性

研究表明，大多数AvBDs显示出良好的抗微生物活性。企鹅AvBD103b对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、星形奴卡菌等多种革兰阳性菌均具有杀灭作用［16］。鸡AvBD9在2～4μmol/L浓度下即对多数革兰阳性菌和革兰阴性菌具有抑制效果［8］。许多其他禽类防御素也具有广谱抗菌活性(表1)。目前，关于AvBDs抗微生物机理研究较少。据推测，AvBDs可能与其他动物的防御素一样，能通过扰乱脂质双分子层等方式发挥抗病原微生物的作用。带正电荷的AvBDs能与富含负电荷的细胞膜结合，然后将疏水性的肽段插入到脂质双分子层中，导致细胞膜通透性增加，最终达到杀菌目的。带正电荷低的AvBDs通常抗菌效果也较差，这说明AvBDs所带电荷对其抗菌非常重要。研究还发现，AvBDs的二级结构对杀菌同样重要。缺少二硫键的线性AvBD2分子杀菌效果降低，无法有效杀灭金黄色葡萄球菌，但对大肠杆菌仍具有杀菌效果［17］。许多AvBDs的抗菌活性受盐离子浓度、pH值等理化因素的影响［8，14］。高盐条件下(例如氯化钠浓度达到150mmol/L)，AvBDs的抗菌活性往往会受到抑制。

4.2抗病毒活性

已报道，某些AvBDs对病毒具有抑制作用。鸭AvBD1、AvBD3、AvBD6等能抑制鸭肝炎病毒(DHV)的增殖，延长鸭胚接毒后的存活时间［21］。鸡胚成纤维细胞感染流感血凝素重组痘病毒后，AvBD4、AvBD6的表达量会升高［25］。体外试验表明，鸡AvBD2、AvBD6和AvBD12具有抑制传染性支气管炎病毒的作用［26］。

4.3免疫调节作用

除了抗微生物活性外，AvBDs在禽类体内还发挥着多种免疫调节作用，例如趋化作用和细胞分化。有研究表明，鸡AvBD13对LPS处理的脾脏淋巴细胞的增殖分化具有促进作用［27］。鸭AvBD2能趋化DT40B淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞等［19］。

4.4在禽类生殖中的作用

近些年的研究表明，某些AvBDs在生殖器官中大量表达，可能与禽类的生殖有密切关系。从现有的研究结果来看，AvBDs在生殖器管中的表达可能有两方面的作用:一方面，参与生殖系统的抗感染，构成生殖系统抗感染的重要防线;另一方面，可能参与了禽类的生殖细胞分化，并维持生殖细胞的正常活力。鸡AvBD1、AvBD2等9种防御素在组织中有表达，其中一些防御素在公鸡性成熟过程中表达量上升［28］。母鸡感染沙门菌后，AvBD5、AvBD7等防御素在阴道中的表达量上调［29］。公鸡感染沙门菌后，AvBD10、AvBD12、AvBD14在中的表达量上调［30］。

5展望

禽类防御素显示出广谱抗微生物活性，在新药开发领域具有较好的前景。目前，禽类防御素的应用还存在许多问题，例如表达量少、人工表达物活性低、分离纯化困难、人工合成成本高、临床应用的安全性和有效性有待确定等，这些都是需要探索和解决的问题。相比哺乳动物的防御素研究，禽类防御素的研究还较少。相信随着研究的深入，人们对禽类防御素的认识会越来越清楚，改造和利用禽类防御素的能力也会得到提升。希望在不久的将来，禽类防御素能广泛应用于疾病防治，为人类的生产生活提供帮助。

作者：卢顺 高其双 彭霞 陈志华 周莉 刘武 陈洁 陶弼菲 夏瑜 童伟文 王连芳 喻婷 单位：武汉市畜牧兽医科学研究所