降解型长效孕激素缓释注射埋植剂的制备方法

摘 要 目的：研究降解型长效孕激素缓释注射埋植剂的制备方法。方法：以左旋聚乳酸及己内酯改性聚乳酸来调节含有孕激素微球的降解速率，以溶媒挥发法为制剂的制备方法。结果及结论：经优化改良后，制得的制剂分散性好，二氯甲烷残留量符合国家药典标准，制剂体外释放实验结果表明，3个月后仍能稳定释放达40 μg。

关键词 孕激素 左旋聚乳酸 缓释 溶媒挥发法 注射埋植剂

中图分类号：R944.9 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2015）11-0067-03

ABSTRACT Objective： To establish a method for the preparation of degradable long-acting progesterone sustained-release injectable implant. Methods： The degradation rate of microspheres containing progesterone was regulated by poly-L-lactic acid and caprolactone-modified polylactic acid. The implant was prepared by solvent evaporation. Results： The prepared formulation showed an excellent dispensability and the residue of methylene chloride conformed to Chinese pharmacopoeia standard. The results of in vitro release of the formulation demonstrated that the stable release could be maintained at 40μg within three months.

KEY WORDS progesterone； poly L-lactic acid； controlled Crelease； solvent evaporation； implantable injection

左旋聚乳酸 （poly L-lactic acid，PLLA） 是一种新型的并广泛应用于医学领域的生物可降解高分子材料，其具有良好的生物相容性，在体内代谢最终产物为二氧化碳和水，代谢的中间产物乳酸也是体内正常代谢的产物，对人体不会产生不良反应，使用非常安全[1]。但仅依靠PLLA的分子量及其分布来调节其降解速度具有很大的局限性，所以，应用聚乳酸及改性聚乳酸等生物医学工程高分子材料在缓释微球注射制剂方面是非常有前途的，对PLLA及改性聚乳酸的深入研究是很有意义的[2]。孕激素，如左炔诺孕酮（levonorgestrel，LNG）， D-甲炔诺酮、左旋18-甲炔诺酮、左旋甲基炔诺酮、左旋甲基炔诺孕酮、左旋甲炔诺酮等，是目前应用较广的一种避孕药，它可以抑制排卵并阻止孕卵着床，同时使宫颈黏液浓度增大，阻止前进，主要用作探亲避孕药和紧急避孕药，也可用于治疗月经不调，子宫功能性出血及子宫内膜异位症等。但目前市售的口服避孕药，对于药物用量及时间要求繁琐，漏服则会导致突破性出血甚至避孕失败。

本文研究一种降解型长效孕激素缓释注射埋植剂的制备方法，单纯聚乳酸作为释药载体其溶蚀速率较快，15 d左右基本降解完毕[3]，本研究应用PLLA及己内酯改性聚乳酸来调节含有孕激素微球的降解速率，使其可以达到稳定缓释3个月。

材料与方法

材料

PLLA、己内酯改性聚乳酸（山东省医疗器械研究所）；左炔诺孕酮（北京紫竹药业）；聚乙烯醇、二氯甲烷、乙腈、吐温-80（上海天莲精细化工有限公司）；高效液相色谱仪（日本岛津SHIMADZU LC-20A）；气相色谱仪（ 日本岛津SHIMADZU GC2010， TurboMatrix HS40顶空分析自动进样器）。

制备方法

本研究的降解型长效孕激素缓释注射埋植剂选用溶媒挥发法，操作步骤如下：将含有左炔诺孕酮与PLLA及己内酯改性聚乳酸中的1种或2种溶于二氯甲烷中[4]，在搅拌条件下滴入聚乙烯醇溶液中，在25 ℃下高纯氮吹5 h以挥发二氯甲烷，然后经常规方法从混悬液中收集微球，无菌处理后灌装，即得降解型长效孕激素缓释注射埋植剂。

体外释放实验

将适量缓释注射埋植剂混悬于缓冲液中，将装有混悬液的半透膜装置置于125 ml广口瓶内，瓶内装有介质50 ml超纯水，再置于37 ℃的恒温水浴箱内，振幅6 cm，速度60 r/min。每24 h取出，测量释放液并更换新的介质，释放量可接受范围在体外释放35～70 μg/d，释放液用HPLC检测。

缓释注射埋植剂含量测定

采用HPLC分析测定缓释注射埋植剂中孕激素的含量，取50 mg注射剂加入10 ml乙腈内，超声后加甲醇定容，取上层清液离心，速度4 000 r/min，离心后移取适量溶液至100 ml甲醇中定容，定容后取样进针。

体外释放及含量测定实验HPLC 条件：将流动相调整为甲醇与水80：20（v/v），将梯度程序调整为等度，流速为1 ml/min，波长为240 nm，柱温35 ℃，进样量为80 nl，出峰时间为6.7 min，采集时间为10 min。

二氯甲烷残留量测定

取10 mg注射埋植剂放入容量瓶内，加入4 ml水，密封，超声震荡后放入水浴锅内加热，取上层气体1 ml进样，采用气相色谱仪分析。

溶液制备

对照储备溶液的制备：精密称取环氧乙烷50 mg，置25 ml容量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀，精密量取1 ml溶液，置50 ml容量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀，作为对照储备溶液。

对照溶液的制备：精密量取2 ml对照储备溶液，置100 ml容量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。精密量取5 ml对照溶液，置20 ml顶空瓶中，密封。

供试品溶液的制备：取本品1根，抽出T状纵臂后精密称定，用刀片将IUD横向切开，将药物核心与不透明膜剥离，置于20 ml顶空瓶中，精密加入超纯水5 ml，振摇，密封，作为供试品溶液。

色谱条件

柱温：起始温度20 ℃，保持7 min，FID检测器温度为260 ℃，进样口温度为200 ℃，分流比30：1，载气为高纯氮气。

顶空条件：炉温为80 ℃，平衡时间为30 min，传输系统温度为60 ℃，传输管温度为140 ℃，加压时间为10 s，取样时间为5 s，样品传输时间为20 s。

测定方法

对照品、样品供试液依法进样，按外标法以峰面积计算，即得。含二氯甲烷不得超过0.01%。

结果

孕激素缓释注射埋植剂的处方筛选

PLLA分子量对包封率的影响

PLLA作为缓释注射埋植剂的主要包封材料，其分子量直接影响到注射剂的包封率，随着PLLA分子量的增大，其黏度也随之提高，包封率相应提高，但若PLLA分子量过大，其黏度导致孕激素无法充分混悬于混悬液中，从而导致包封率降低，分子量与包封率的研究数据见表1。

内酯改性聚乳酸/ PLLA比例对包封率的影响

相同分子量的PLLA与己内酯改性聚乳酸的不同比例会影响到注射埋植剂的包封率，己内酯改性聚乳酸在疏水性上占有优势，但是随着己内酯改性聚乳酸的比例不断增加，会导致包封率下降，并导致降解速率过慢。已内酯改性聚乳酸/ PLLA比例对释放周期的影响见表2。

制备工艺验证

此制备方法采用的溶媒挥发法经过改良优化，可以得到包封率在80%的缓释制剂，所得制剂微球外观平滑，表面无左炔诺孕酮残留。

批次20140820的体外释放结果：取分子量为2 000 的PLLA 1 g，加1：1的己内酯1 g，加左炔诺孕酮10 mg，二氯甲烷40 ml。包封率为82.4%，二氯甲烷的残留量符合国家标准，微球的均一性也达到了制剂的质量标准。体外释放90 d的验证结果见图1。

体外释放实验

本研究显示，缓释注射埋植剂加入混悬液后对其产生聚集抑制作用，对其体外释放效果有明显提高。本研究的缓释注射埋植剂在前3 d突释，10 d之后释放量趋于平缓，左炔诺孕酮呈现持续平稳释放，70 d后释放量降低至40 μg，并持续释放3个月。

二氯甲烷残留量结果

制备时间对二氯甲烷残留量的影响

以同样的方法、同样的投料量，不同的高纯氮吹气时间，制备3批注射埋植剂，以测定制备时间对二氯甲烷残留量的影响。每批测定3次，结果见表3。

结果表明，该法制备的制剂在5 h的二氯甲烷残留量均小于0.06%，符合药典规定，故采取高纯氮吹气5 h的制备方法。

3批固定制备时间制剂二氯甲烷残留量的测定

测定3批固定制备时间制剂的二氯甲烷残留量，每批测定3次，结果见表4。

结果显示，该法制备的制剂中二氯甲烷的残留量均小于0.06%，符合国家药典规定，故本制备方法可以实施。

结论

本研究已申请国家专利《长效孕激素缓释注射埋植剂及其制备方法》，申请号：201210052937.4。在优化制剂工艺的同时又使得制剂分散性较好，二氯甲烷残留量符合国家药典规定[5]，制剂可稳定释放3个月以上。本研究的聚合材料经药物缓释一段时间后，可降解为无毒安全的小分子并被人体吸收，制剂经注射后可解决女性经口服带来的繁琐步骤并可避免口服制剂给人体其他器官带来的潜在危害。本文所标的左炔诺孕酮制剂作为将来临床应用的又一选择。它的避孕有效率和制剂的稳定性在动物试验中已经得到了肯定，而且本项目得到了美国比尔盖茨基金的资助

本实验需要进一步探讨和研究的是：①微球尺寸的均一，是制剂质控的重要标准之一，因为搅拌速度和温度的控制，对微球的形成会有很大的影响。②溶剂残留量控制也是本制剂的关键之一，加氮气量的大小、温度、时间的长短，均会影响到溶剂的残留。③辅料和药物降解速率的等同度，是可能面临的一个问题。

参考文献

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（收稿日期：2015-05-08）