不同浓度6BA对黑麦草种子出愈率的影响

摘要：研究了不同浓度6BA对多年生黑麦草4个品种夜影、蒙特利Ⅲ、高帽和德比极品的种子愈伤组织诱导率的影响。结果表明，在一定的浓度范围内，6BA 能够提高多年生黑麦草愈伤组织的出愈率，但随着浓度的增加反而会降低黑麦草愈伤组织的出愈率。夜影品种愈伤组织诱导的浓度为0.1、0.3 mg/L；诱导德比极品品种愈伤组织的浓度为0.2、0.3 mg/L都适宜；诱导蒙特利Ⅲ品种成熟种子愈伤组织的浓度以0.1 mg/L为佳；高帽品种成熟种子诱导愈伤组织的浓度为0.1、0.2 mg/L。

关键词：多年生黑麦草；种子；6BA；愈伤组织诱导

中图分类号：S 54文献标识码：A文章编号：10095500(2014)03002005

多年生黑麦草(Lolium perenne)属冷季型禾草，由于其为异花风媒传粉禾本科植物，高度自交不亲和，优良基因难以纯合稳定下来，这使其遗传改良困难而复杂，用传统的方法育种，耗时费力，困难大，难以取得突破性进展。因此，组织培养和遗传转化技术的发展为多年生黑麦草的遗传改良开辟了一条新途径。1975年，Dale\[1\]首先通过茎尖分生组织培养获得了可育的多年生黑麦草再生植株。Spangenberg等\[2\]首先用基因枪转化法得到黑麦草转基因植株。近年来，有利用基因工程培育和改良黑麦草品种的研究报道，且愈伤组织可以作为基因枪法和农杆菌介导转化法的受体，因此，对愈伤组织培养的研究是十分必要的\[3\]，获得高质量的愈伤组织才能够为进一步的诱导分化和生根提供物质前提\[4\]。

目前，国内以黑麦草成熟种子为外植体的研究中，曾升坚等\[5\]得出，在MS培养基中附加8 000 mg/L的2,4D和0.025 mg/L的6BA时诱导率最高。而徐定炎等\[6\]认为，黑麦草成熟种子愈伤组织诱导率最高时6BA 浓度为0 mg/L；吴莲蓉等\[7\]筛选出黑麦草成熟种子愈伤组织诱导的最佳组合为：0.05 mg/L的6BA浓度+黑麦草品种特高+CC基本培养基。杨茹等\[8\]通过试验认为，2,4D浓度在7 mg/L、6BA浓度为0.1 mg/L时有利于多年生黑麦草成熟种子诱导产生愈伤组织；杜雪玲等\[9\]通过试验表明，2,4D为5 mg/L，6BA为0.05 mg/L时，黑麦草各品种愈伤组织的质量和诱导率最高；代亮等\[10-12\]的研究表明，基因型的差异会导致品种对6BA的敏感度不同，在愈伤组织培养时需要谨慎使用6BA。多年生黑麦草组织培养条件的影响因素依然是一个亟待研究的重要课题。因此，选取不同品种的多年生黑麦草成熟种子为外植体，研究不同浓度6BA 对多年生黑麦草愈伤组织诱导的影响，并试图找到6BA 最佳浓度及能产生高出愈率的黑麦草基因型（品种），为多年生黑麦草组织培养及遗传转化打下基础，培育和筛选出我国草业生产所需的抗逆性强的优质多年生黑麦草草种。

1材料和方法

1.1供试材料

选取夜影（Evening shade,E）、蒙特利Ⅲ（MontereyⅢ,M）、高帽（Top hat,T）和德比极品（Derby Xtreme,Dx）4个抗性良好的多年生黑麦草品种。

1.2外植体的消毒与接种

将适量的各个品种的多年生黑麦草种子置于离心管中，加入次氯酸钠溶液（活性氯7%，约50 mL）和2滴Tween20，振荡消毒40~50 min，然后用无菌蒸馏水清洗6次以上\[13\]。放置于4 ℃冰箱2~3 d。再次用无菌蒸馏水清洗3次，滤纸滤干水分后直接接种。

1.3培养基的配置

以MS基本培养基为基础，加入3 g/L植物凝胶或8 g/L琼脂，30 g/L蔗糖，调节pH至6.0，高压灭菌15 min（121 ℃），观察其他因素对愈伤组织诱导的影响。

MS基本培养基：MS大量元素+MS微量元素+MS铁盐+MS有机成分。

愈伤组织诱导培养基：MS基本培养基+6BA+4.0 mg/L 2,4D＋0.1 g/L水解酪蛋白（AHC）+0.1 g/L肌醇+蔗糖30 g/L+8 g/L琼脂。

6BA浓度梯度为0、0.1、0.2、0.3和0.5 mg/L。

1.4愈伤组织诱导

将经过消毒处理的4个多年生黑麦草品种的种子，在无菌操作台上，接种到不同6BA浓度梯度的培养基中，每个培养皿接种40 粒种子，用塑料薄膜封口，置于25~26 ℃的避光培养条件下进行愈伤组织诱导培养。出芽后，待芽长至2~3 cm，将芽从基部拔断去除，将种子留在培养基上，在25~26 ℃避光培养。

1.5试验处理

附加了4.0 mg/L 2,4D的MS基本培养基上，设置了0、0.1、0.2、0.3和0.5 mg/L 5个不同6BA浓度作为试验处理，研究了夜影、蒙特利Ⅲ、高帽和德比极品的愈伤组织诱导率。每个培养皿接种40颗种子，以每一培养皿为1个处理，各处理重复4次。

1.6愈伤组织观察及记录

不同品种的多年生黑麦草种子消毒后，分别接种于诱导愈伤组织的不同浓度梯度的培养基中，接种7 d 后开始统计种子的发芽率和出愈率，每隔5 d 统计1 次，记录数据。按如下公式和标准记录各处理的发芽率和出愈率：

发芽率（%）= 发芽种子数/接种数×100%

出愈率（%）= 愈伤组织不再变化后的愈伤组织块数/接种数×100%

1.7数据统计与分析方法

对各组培处理的发芽率、出愈率等数据，采用Excel和SPSS统计分析软件分别进行统计分析和显著性测验。

2结果与分析

2.1不同浓度6BA对多年生黑麦草发芽率的影响

先将经过消毒处理的4个多年生黑麦草品种的种子接种到附加不同浓度6BA的培养基上，7 d暗培养，种子开始发芽，统计发芽率（表1）。

在6BA浓度为0 mg/L的培养基中，4个品种成熟种子的发芽率除了T能达到50.6%之外，其他都低于50%，发芽率很低。随着6BA浓度的增加，培养基中种子的发芽率相对增加，对于E品种来说，最高的发芽率达95.0%。在6BA浓度为0.2 mg/L的培养基中，4个品种成熟种子的发芽率相同且处于较高水平（80%以上）。而后，Dx和T两个品种的发芽率有所下降，E和M两个品种的发芽率相对增加。说明6BA有促进黑麦草种子萌发的作用。

Dx品种在6BA浓度为0.2 mg/L时的发芽率显著高于0，0.1和0.5 mg/L浓度处理，高于0.3 mg/L浓度处理的发芽率但不显著（表1）。T品种在6BA浓度为0.2 mg/L时的发芽率显著高于其他4个浓度处理。而E和M品种的发芽率在6BA浓度为0.2、0.5 mg/L时的发芽率显著高于其他2个处理。

表1不同浓度6BA处理下多生黑麦草的发芽率

Table 1Effects of 6BA on germination rate of different

ryegrass varieties under different concentrations

处理浓度

/mg・L-1 E Dx M T

发芽率/% 发芽率/% 发芽率/% 发芽率/%

0 29.4c 25.6d 31.3c 50.6c

0.1 56.3b 61.9c 69.4b 58.8c

0.2 91.3a 86.3a 84.4a 88.8a

0.3 93.8a 81.3a 90.6a 74.4b

0.5 95.0a 73.1b 87.5a 71.3b

注:同列不同小写字母表示差异显著（P

因此，诱导T和Dx品种成熟种子萌发的6BA浓度以0.2 mg/L为佳；诱导E和M品种成熟种子萌发的6BA浓度0.2、0.5 mg/L时都适宜，推荐选用低浓度以节省成本。试验还观察到愈伤组织的形成晚于芽的产生，能产生愈伤组织的种子，一般不萌芽或者芽的伸长生长慢于未产生愈伤组织的种子。

2.26BA对多年生黑麦草不同品种出愈率的影响

由于不同品种的基因型不同，愈伤组织的诱导效应也不同，试验表明，同一种类的不同品种间，其外植体对同一培养基的反应存在差异。因此，要得到再生能力较强的品种，首先要对多年生黑麦草品种筛选。

E品种在6BA浓度为0.1、0.3 mg/L时的出愈率显著高于0和0.5 mg/L处理（图1），而在这3个浓度处理之间的出愈率没有显著的差异。其愈伤组织的平均出愈率最大值为58.1%。因此，E品种愈伤组织诱导的最适浓度为0.1、0.3 mg/L。

Dx品种在6BA浓度为0.2和0.3 mg/L时的出愈率分别显著高于0和0.5 mg/L处理，高于0.1 mg/L浓度处理的出愈率，但差异不明显，其愈伤组织的平均出愈率最大值为73.1%。因此，Dx品种愈伤组织诱导的最适浓度为0.2和0.3 mg/L。

图1不同浓度6BA处理下各品种的出愈率

Fig.1Callus induction rate of each cultivar under

different concentrations of 6BA

注:不同小写字母表示α=0.05水平上差异显著，下同

M品种在6BA浓度为0.1 mg/L时的出愈率显著高于0，0.2和0.5 mg/L处理，高于0.3 mg/L处理的出愈率但差异不显著。其愈伤组织的平均出愈率最大值为71.3%。因此，M品种愈伤组织诱导的最适浓度为0.1 mg/L。

T品种在6BA浓度为0.1和0.2 mg/L时的出愈率分别显著高于0和0.3 mg/L，高于0.5 mg/L浓度处理的出愈率但不显著。其愈伤组织的平均出愈率最大值为72.5%。因此，T品种愈伤组织诱导的最适浓度为0.1和0.2 mg/L。

4个品种的多年生黑麦草成熟种子由于基因型的不同，其愈伤组织的诱导率不同，而且6BA对愈伤组织的诱导率的影响也不同。

在0和0.1 mg/L低浓度的6BA处理下，4个品种成熟种子的出愈率之间没有显著差异，4个品种的种子对6BA的敏感度相似。随着6BA浓度的增加，在0.2 mg/L时，Dx和T品种的出愈率显著高于E和M品种，而Dx和T品种之间没有显著差异；在0.3 mg/L时，Dx品种的出愈率显著高于其他3个品种（图2）。由此可见，在6BA浓度增加后，每个品种对于6BA的敏感度存在差异性，Dx品种对于6BA浓度的敏感性最弱，出愈率受其影响最小，其次是T品种。因此，多年生黑麦草的基因型对其成熟种子的出愈率存在一定的影响。

图2不同浓度6BA处理下各品种的出愈率

Fig.2Callus induction rate of each cultivar under

same concentration of 6BA

3讨论与结论

3.1讨论

愈伤组织诱导中，愈伤组织诱导率取决于品种基因型、诱导培养基附加激素等多种因素相互影响、相互作用。首先，选择适宜的培养基附加激素浓度是提高愈伤组织诱导频率，获得高质量愈伤组织的基础。

试验是在已有4.0 mg/L 2,4D的诱导培养基中加入少量的6BA，研究不同6BA浓度对多年生黑麦草出愈率的影响。段碧华等\[14\]、马彩云\[15\]、丁路明\[16\]的研究报道，在培养基中添加少剂量的6BA可以增加愈伤组织出愈率。

高浓度的6BA对愈伤组织诱导起抑制作用，随着6BA 浓度的增加抑制作用越明显。这与杨茹等\[8\]、梁华等\[17\]的研究结果相一致。但与其他人的结论有着差别，这可能与所用的黑麦草品种有关。因为试验发现对于Dx品种而言，6BA 浓度在0.2、0.3 mg/L比较适宜。因此，还需要做进一步的研究。

吴莲蓉等\[7\]的研究表明，黑麦草的发芽率与6BA的浓度相关不明显，与其出愈率也无相关。而试验得出，多年生黑麦草成熟种子的发芽率在0.2和0.3 mg/L浓度时最大，与出愈率有一定的关系。因此，需要进一步研究6BA的浓度对种子发芽率是否有促进作用，还有发芽率与出愈率之间的关系。

试验的诱导培养基中，加入了肌醇和水解酪蛋白（AHC）。肌醇能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成，对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞的形成也有促进作用，

而水解酪蛋白则可以促进胚性愈伤组织的诱导\[18\]。崔凯荣等\[19\]认为，加入水解酪蛋白对诱导胚状体起关键作用。因此，肌醇和水解酪蛋白的浓度是否对愈伤组织的诱导存在影响则需要其他试验来研究。试验选用次氯酸钠对植物材料进行消毒，其对植物材料和试验人员的损伤小，且灭菌效果好。然后采用磁力搅拌，使种子与次氯酸钠充分接触，种皮脱落，利于种子萌发出芽以及愈伤组织形成。但由于品种之间的差异，不同品种种皮脱落的程度不同，可能对试验结果造成一定的影响。

3.2试验结论

（1） 在一定的浓度范围内，6BA 能够提高多年生黑麦草愈伤组织的出愈率，但随着浓度的增加反而会降低黑麦草愈伤组织的出愈率。在不考虑4个多年生黑麦草品种的差异性的情况下，0.1 mg/L处理为最适宜的多年生黑麦草愈伤组织诱导的6BA浓度。

(2)Dx品种对于6BA浓度变化的敏感性最弱，出愈率受其影响最小，其次是T品种。Dx品种的愈伤组织诱导率比其他3个品种的高，而E品种的愈伤组织诱导率是4个品种中最低的。

(3)E品种诱导成熟种子萌发的6BA浓度在0.2~0.5 mg/L时都适宜，而诱导愈伤组织的浓度在0.1~0.3 mg/L；诱导Dx品种成熟种子萌发的6BA浓度以0.2 mg/L为佳，而诱导愈伤组织的浓度在0.2~0.3 mg/L时都适宜；诱导M品种成熟种子萌发的6BA浓度在0.2~0.5 mg/L，而诱导愈伤组织的浓度以0.1 mg/L为佳；诱导T品种成熟种子萌发的6BA浓度可选择0.2 mg/L，而诱导愈伤组织的浓度可在0.1~0.2 mg/L。

综合本次试验的结论，诱导多年生黑麦草品种愈伤组织最佳6BA浓度夜影在0.1、0.3 mg/L，德比极品在0.2、0.3 mg/L，蒙特利Ⅲ为0.1 mg/L，高帽在0.1、0.2 mg/L。能产生高出愈率的为德比极品。

参考文献:

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Effects of 6BA with different concentrations on callus

induction rate of ryegrass seeds

WEN Peiling1,QU Yang2,YE Guangming1,YANG Bingjian1,DU Xiaojiao1

（1.Shenzhen Risheng Gardening Co.,Ltd,Shenzhen 518040,China； 2.Institute of Turfgrass Science

of Beijing Forestry University,Beijing 100083,China）

Abstract：The mature seeds of four perennial ryegrass cultivars (Evening Shade,Monterey Ⅲ,Top Hat and Derby Xtreme) were selected as explants to study the effects on callus induction.The result showed that 6BA could increase rate of callus induction in a certain concentration range.However,as the concentration of 6BA increased,the rate of callus induction decreased.The optimum concentrations of 6BA were0.1 mg/L to 0.3 mg/L for Evening Shade,0.2 to 0.3 mg/L for Derby Xtreme,0.1 mg/L for Monterey Ⅲ and 0.1 mg/L to 0.2 mg/L for Top Hat.

Key words：callus induction；perennial ryegrass；mature seed；6BA