浮游病毒的电镜观察

摘要：直接用戊二醛固定水样中的浮游病毒，通过超速离心使已固定的浮游病毒沉淀到覆有Formvar膜和碳支持膜的铜网上，经醋酸双氧铀染色后，利用透射电镜对湖水中的浮游病毒进行观察，结果可观察到球形、杆状和蝌蚪状等形态各异的浮游病毒颗粒及球形病毒的囊膜子粒、杆状病毒的核衣壳、具有不同尾部的蝌蚪状病毒等的精细超微结构，从而建立了一种简便、快捷和高效研究浮游病毒的电镜方法。

关键词：电镜观察；浮游病毒：超微结构

中图分类号：Q939.48

文献标识码：A

文章编号：1007-7847(2007)01-0048-04

电镜技术已广泛用于病毒的形态特征、分子结构以及与宿主细胞相互作用的研究，电镜观察可为病毒的形态、超微结构及分类定位提供最直观的依据，但要通过电镜对水样中的病毒进行观察，通常必须对水样进行浓缩和病毒分离，

浮游病毒是存在于水体中的病毒，浮游病毒也是指水生态系统中的病毒，目前被普遍认为是水体微生物群落中丰富且重要的活性成分，它能调节水体中异养细菌，蓝藻和真核藻类的物种多样性和生物产量，影响生物地化循环，介导水生态系统中微生物之间的基因转换，对水环境乃至整个生态系统都具有重要影响，因此受到人们的广泛关注，近些年已有报道指出，浮游病毒存在不同的形态类群。

从水样中分离浓缩病毒，不仅过程繁杂、耗时长、费用高，还会使水样中病毒的数量及完整性受损，可否免去分离浓缩程序，直接对水样中的浮游病毒进行制样和电镜观察呢?因此，本文着重对水样中浮游病毒样品的不同制备方法及电镜观察效果进行比较。

1 材料与方法

1.1 水样的采集

将取样器浸入武汉东湖水面以下10cm处取出水样，装入收集瓶内，立即加入戊二醛(按体积比水样：戊二醛=9:1，使之终浓度为2.5％)进行固定，并迅速将固定后的水样置于4℃冰箱内保存，备用。

1.2 制样

方法之一：水样直接滴到铜网上，采用常规的滴染法，即把水样直接滴在覆有Formvar膜和碳支持膜的铜网上，使形成一小液珠，放置片刻，用滤纸条吸去多余的液体，自然干燥。

方法之：水样经超速离心到铜网上，参照刘艳鸣等的方法(2005)，以25000r/min离心3h，使病毒沉淀到铜网上，弃去上清，空气干燥，

1.3 染色

醋酸双氧铀染色，在蜡盘中滴加2％的醋酸双氧铀，然后将上述干燥好的铜网漂浮在染液上，染色2－3min。

磷钨酸染色，将2％的磷钨酸滴加到蜡盘中，将上述干燥好的铜网插入其中，染色2－3min，

1.4 电镜观察

在JEM－1230型透射电镜下观察，加速电压为100kV，利用GATAN INC CCD图像传输系统，获得电镜图片。

2 结果

2.1 制样方法对观察效果的影响

我们分别采用了两种制样方法和两种染色方法。结果显示：不同的制样和染色方法对电镜观察效果有明显的影响。

利用方法一所制备的样品，无论经醋酸双氧铀染色，还是磷钨酸染色，都存在杂质多，背景暗，而病毒颗粒少的情况，甚至许多视野看不到病毒颗粒，可见，该方法不适宜制备浮游病毒的样品。

利用方法二所制备的样品，经磷钨酸染色后，整个图像背景杂乱，病毒颗粒分布不均匀，形态模糊，该方法也无法对水样中的浮游病毒进行准确观察。

同样利用方法二所制备的样品，经醋酸双氧铀染色后，可观察到大量形态和数量不同的病毒颗粒，因此该方法可有效用于浮游病毒的形态观察及计数分析，下述电镜图片均是通过该方法得到的。

2.2 浮游病毒的种类、形态及精细结构

用方法二所制备的浮游病毒样品，在透射电镜下，不仅可清晰地观察到病毒颗粒的形态，如球形、杆状和蝌蚪状等(图1)，还能了解其部分精细结构，包括球形病毒的子粒、杆状病毒的核衣壳(横纹状结构)和蝌蚪状病毒的尾髓等(图2)。

2.3 浮游病毒的计数分析

在进行样品观察时，可以根据需要来调节电镜的放大倍数，如要了解病毒的精细结构时，可将放大倍数调节到8－10万倍；如要对水样中的浮游病毒进行计数分析，就将放大倍数调低至2万倍左右，在此条件下，视野较宽，病毒的形态及数量都清晰观察到(见图1B)。

3 讨论

我们采用了不同的制样和染色方法，对水体中的浮游病毒进行观察，结果显示，常规的直接滴染法虽然简便快捷，但由于浮游病毒在水体中的含量与分离或纯化后的样品相比，其量相对较少且分布不均匀，图像背景杂乱、不清晰，故很难获得满意的电镜图片，其原因可能是浮游病毒和水中的其它浮游生物、细胞碎片等固体杂质混在一起，吸附到铜网上，对病毒形态的观察和图片拍摄造成干扰。

采用超离法制样，可得较好的结果，这是由于在离心力的作用下，一些比病毒颗粒要大的物质首先沉降到铜网上，并形成一个电子密度高且较均匀的背景，为浮游病毒的观察起托衬作用，值得注意的是，此方法的离心速度较为关键，实验表明，用25000r/min的转速(Beckman L-90K超速离心机，SW41转头)比较适宜，这是由于用过大的离心速度，就会使有蝌蚪状病毒的尾巴折断或损伤；而离心速度过小，则难使体积较小的病毒沉降到铜网上，不能全面真实地反映待检水体中浮游病毒的形态多样性及含量等情况，另外，每次离心加入待测水量的多少，要根据水样中浮游生物、其它悬浮颗粒物的含量以及湖水的富营养化程度等因素来定，在超富营养区的水样中，细菌、藻类等浮游生物及其它悬浮杂质较多，每次可加入1mL左右的水样；而来自富营养区的水样，每次加入1.5mL左右；来自中等营养区的水样，则要加入2mL左右，这样才能使离心到铜网上的样品分布均匀、数量适中，能获得较好的观察效果。

用磷钨酸对浮游病毒进行染色，只产生负染效应，由于它与支持膜的粘附作用很弱，染色后的标本不能久留，因此，常难以观察到浮游病毒的精细结构，当我们选用醋酸双氧铀溶液作为染色剂时，由于醋酸双氧铀可产生正染和负染两种效果，在铜网中杂质多、背景暗的区域可观察到浅色的病毒颗粒；在浅色的背景下则可观察到深色的病毒颗粒，因此，处理得当，就能有效观察到不同背景条件下的浮游病毒颗粒，同时，醋酸双氧铀容易与支持膜粘附，产生较强的反差，染色后的标本较稳定，有利于保存。

在建立了适宜浮游病毒制样和染色方法的基础上，获得了不同病毒颗粒形态的图片、病毒精细结构的图片，这显示所建立的方法，能简便、有效地用于浮游病毒的研究，包括用于浮游病毒的计数分析。

注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。

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