胸段硬膜外阻滞联合中药对哮喘大鼠IL-12 GM-CSF的影响

姜廷枢　张碧海　刘　晓　赵丽红　张　丽　王　稳　薄志坚

摘　要：目的：探讨中药联合胸段硬膜外阻滞对哮喘大鼠肺泡灌洗液GM－CSF、血清中IL－12水平的影响。方法：将健康大鼠40只(雌雄各半)按随机数字表将其分为5组：空白组(A组)、哮喘模型组(B组)、中药组(C组)、胸段硬膜外阻滞组(D组)、胸段硬膜外阻滞+中药组(E组)。建立大鼠哮喘模型以及胸段硬膜外阻滞的模型，采用中药灌胃及硬膜外给药，用ELIsA法检测大鼠血清当中IL-12、肺泡灌洗液中GM-CSF水平的变化。结果：哮喘大鼠血清中IL-12水平明显降低，肺泡灌洗液中GM-CSF水平明显升高。中药与硬膜外阻滞以及二者的联合应用均可抑制IL-12水平的下降和GM-CSF水平的升高。二者联合应用组IL-12的下降、GM-CSF水平的升高低于中药组与单纯硬膜外阻滞组。中药组与单纯硬膜外阻滞组IL-12、GM-CSF含量无显著性差异。结论：胸段硬膜外阻滞联合中药对IL-12的下降及GM-CSF的升高有明显的抑制作用。

关键词：中药；哮喘；硬膜外阻滞；IL-12；GM-CSF

支气管哮喘是呼吸道慢性变应性炎症性疾病，其发病率及患病率不断上升。笔者建立胸段硬膜外阻滞联合中药对哮喘大鼠模型，检测大鼠血清中IL-12、肺泡灌洗液中GM-CSF的水平，从免疫学角度探讨其对哮喘的防治作用，从而为此方法应用于临床治疗哮喘提供理论和实验依据。

1 实验材料

1．1　实验动物选用健康SD大鼠40只(雌雄各半)，体重230―300g(由中国农业科学研究院哈尔滨兽医研究所动物实验室提供)，在室温18℃―28℃，相对湿度40％一70％的屏障系统内饲养。

1．2　主要仪器雾化吸入器；低温高速离心机；酶标仪；洗板机。

1．3　主要试剂卵蛋白(OVA)购自北京鼎国生物制品公司；AL(OH)，购自上海化工总厂；灭活百日咳菌苗由黑龙江省疾病预防与控制中心提供；IL-12、GM-CSF酶免检测试剂盒由上海森雄科技实业有限公司提供。

2 方法

2．1 实验大鼠分组 40只大鼠按雌雄各半随机分为5组，空白对照组(A组，n=8)；哮喘模型组(B组，n=8)；中药组(C组，n=8)；硬膜外阻滞组(D组，n=8)；硬膜外阻滞联合中药组(E组，n=8)。

2．2 哮喘大鼠模型的建立实验第1天B组、C组、D组和E组每只大鼠腹腔注射抗原混悬液(内含生理盐水加OVA10mg，AL(OH)3 100mg，灭活百日咳菌苗5×109个)ImL致敏；A组腹腔注射等量生理盐水。第8天重复上述操作。

2．3 连续硬膜外阻滞大鼠模型的建立 参照董有静等介绍的方法，根据实际情况作一定的改进，复制硬膜外阻滞大鼠模型。在第8-9日开始对D组、E组大鼠行硬膜外腔置管术并长期留置。用10％水合氯醛(4mL/kg)对大鼠进行腹腔注射麻醉，将麻醉后大鼠取俯卧位固定，消毒后，以大鼠第4～5椎体棘突为中心作一长约2cm纵行切口，分离脊突两侧筋膜及肌肉，用手术钳夹住脊突向上提，切断T4一T5问的韧带，将制备好的无菌导管经黄韧带破口插入，方向向头侧与脊柱纵轴平行，导管送入约2cm，如无清亮的脑脊液外溢即为位于硬膜外间隙。固定导管，避免感染及大鼠咬噬。

2．4　哮喘的激发中药灌胃及硬膜外给药第15天后。B组、C组、D组、E组开始用1％OVA(需新鲜配制)超声雾化吸入激发哮喘，每口1次，每次20min共7日。在每次激发前30min，C组、E组给予浓缩中药汤剂2mL(按体表面积公式)灌胃，D组、E组大鼠从第15天行硬膜外给药，每日注入0.125％Bupivicaine 25μL，8时，17时各1次。

2．5　取材及样品处理肺泡灌洗液的采集与处理：腹腔注射1.5％戊巴比妥钠(0.3mL/100g)麻醉后，开胸后气管插管，用生理盐水5mL注入气管肺组织内，反复抽吸3次，将抽取的肺泡灌洗液放入离心管中3000r/min离心5～10min。取上清液1mL用放置于放免用聚苯乙烯管中，上用塑料封口膜封好，用大头针刺满孔放置真空低温冷冻干燥箱中(-20℃)冷冻，待冻结后打开真空泵过夜(24h)，待成干粉后取出。

血标本的采集：在采集肺泡灌洗液同时，打开胸腔进行心脏取血。采集血液2mL。注入已加入的离心管中，然后立即在4℃、3500r/min离心15-20min，分离后的血浆在一20℃保存。

2．6　检测方法肺泡灌洗液检测之前用加入试剂盒中提供的缓冲液200μL，分别取100μL用于检测；血浆样品复融后在4℃、3500r/min离心15-20min，各取上清100μL用于检测。检测方法按试剂说明书进行。

2．7　统计学处理全部数据均表示为x±s，用t检验比较各组结果。

3 结果

3．1 一般状态观察哮喘模型组大鼠在卵蛋白雾化吸入后出现搔鼻、抖毛、呼唤急促腹部翕动，易激惹，烦躁不安且喷嚏频频，饮水增多，甚则跌倒等动作。对照组(A组)大鼠行动敏捷，未见异常；C组、D组、E组经抗原激发后，也出现B组情况，但症状明显减轻。

3．2各组大鼠细胞因子水平的比较由表1可以看出，哮喘大鼠BALF中GM-CSF水平较正常组明显升高而血浆中IL-12水平明显下降。中药组、连续硬膜外阻滞组以及二者的联合应用组均可抑制GM-CSF水平的升高以及IL-12水平的下降。中药组与连续硬膜外阻滞组GM-CSF、IL-12水平无显著性差异。二者联合应用组GM-CSF水平低于中药 组与单纯硬膜外阻滞组，IL-12水平高于中药组与硬膜外阻滞组，接近正常水平。

4 讨论

GM-CSF是源于T、B淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞及间质细胞的一种糖蛋白，是一种多向性和多效性的细胞因子，对机体造血、免疫、抗感染能力有重要调节和促进作用，参与调节EOS成熟、分化、活化和脱颗粒以及凋亡等过程，在哮喘气道炎症的形成中发挥重要作用。在体外，GM-CSF可以刺激EOS的产生，EOS被公认为通过释放毒性蛋白而在许多炎性和过敏性疾病中起着重要作用，哮喘是与粒细胞尤其是EO$的聚积和活化的炎症反应有关的疾病。研究表明GM-CSF可延长EOS的寿命并对其有直接活化作用，还可促进EOS表面CD11。黏附分子的表达，以增强其在炎症局部的募集，还可以增强EOS的细胞毒性及释放毒性嗜酸蛋白能力，并能促进白三烯的合成。有研究表明，哮喘大鼠BALF中GM-CSF水平明显升高，与哮喘发病有直接关系。

IL-12是由巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞(DC)以及表皮内的朗罕细胞等抗原递呈细胞(APC)，经过不同的刺激途径而产生，现代哮喘理论认为，体内辅助T淋巴细胞(Th)亚群(Thl和Th2)失衡是导致哮喘发病的重要原因，哮喘发病时，Thl功能相对抑制，Th2功能相对亢进。Th亚群的分化受多种因素影响，其中IL-12作用关键。实验证实，哮喘患者IL-12水平低于正常对照组，经变应原刺激后IL-12的生成量也显著低于健康对照者，Nass-er等观察到，过敏性哮喘患者呼吸道活检组织中IL-12mRNA的表达较正常人的表达水平显著降低。这说明IL-12在哮喘发病机制中起着重要作用。国外实验已证实鼠肺部过敏性炎症反应模型实验中，IL-12确有抗炎和抗过敏效应；对灵长类动物模型，呼吸道局部吸入IL-12的治疗，亦取得了较好疗效。

本实验结果表明，接受胸段硬膜外阻滞术的哮喘模型诱导哮喘时症状较对照组减轻，联合中药组基本上没有哮喘症状，证明其对哮喘确实有防治作用。从本实验中大鼠一血清IL-12及BALF中GM-CSF的变化看，胸段硬膜外阻滞术从细胞因子水平上影响着哮喘的发生。从联合中药组看大鼠的IL-12和GM-CSF水平接近正常组，可以看出。

5 结论

胸段硬膜外阻滞对哮喘大鼠模型血清中IL-12的下降及BALF中GM-CsF的上升有抑制作用，当联合中药时候这种作用更明显。此方法对支气管哮喘的防治提供了实验依据。