大黄属药用植物抗HIV—1活性的谱效关系研究

[摘要] 目的：分析大黄属药用植物的超高效液相色谱法（UPLC）特征图谱与抗HIV-1活性之间的相互关系。方法：采用HIV-1 逆转录酶相关的核糖核酸酶H活性测定检测了大黄属16种22个样品的抗HIV-1活性；同时测定了22个样品的UPLC特征图谱；运用数理统计方法研究谱效相关性；并采用UPLC-TOF-MS/MS指认样品主要成分峰。结果：藏边大黄、苞叶大黄和河套大黄提取物有较好的抗HIV-1活性。谱效相关性研究表明4.74，7.99，21.18 min色谱峰与活性有一定相关性。结论：通过谱效研究，推测了有抗HIV-1活性的大黄属药用植物及其活性组分，为大黄属植物深层次的研究开发奠定了基础。

[关键词] 大黄；特征图谱；抗HIV-1活性；谱效关系

传统中药和药用植物来源的天然化合物具有结构多样性、毒性较低、来源广泛等特点， 因而在防治艾滋病方面有着独特的优势和巨大的潜力[1]。近年来，大黄被列为中西医防治AIDS各种机会性感染的有效药物之一[2]。有研究表明一些蒽醌类化合物有体外抗HIV-1的活性[3]；且大黄素衍生物能够抑制HIV-1聚合酶和整合酶的活性[4]。蓼科大黄属植物是我国最为重要的药用植物资源类群之一，同时也是天然蒽醌化合物的主要植物来源；因此筛选有抗HIV-1活性的大黄属植物并深入研究其活性成分十分有意义。

本研究采用大黄属植物对HIV-1逆转录酶相关的核糖核酸酶H活性的抑制作用为评价指标，研究其UPLC特征图谱与药效之间的相互关系，以期表征大黄属植物的抗HIV-1活性成分。

1 材料

美国Waters公司Acquity超高效液相系统，包括二元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、PDA 全波长检测器以及Waters Empower2 数据处理工作站。KQ5200E型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。1/10 万电子分析天平（ AL204型，梅特勒-托利多公司） 。

乙腈为色谱纯（Honeywell B&J Brand，德国），流动相用水为超纯水，其余试剂为分析纯。本实验中样品均为实地采集，经中国科学院植物研究所李安仁教授鉴定。所有样品都保存于中国医学科学院药用植物研究所。样品详细信息见表1。

2 方法与结果

2.1 大黄属植物提取物的制备

精密称取样品5.0 g（量少者取3.0 g），放置于100 mL三角烧瓶中，加入10倍量纯净水（50/30 mL），加热至微沸，维持1 h，取出放冷。5 000 r·min-1离心15 min，分离样品及提取液。样品继续加入10倍量纯净水，加热提取1 h，离心分离提取液及样品。合并2次的提取液，加入等体积的纯净水。-80 ℃条件下冷冻24 h，经冻干处理制成粉末状提取物。

2.2 大黄属植物提取物抗HIV-1逆转录酶相关的核糖核酸酶H活性研究[5-6]HIV-1逆转录酶相关的核糖核酸酶H活性测定采用50 μL反应体系：50 mmol·L-1 Tris-HCl，pH 8.0，2 mmol·L-1二硫苏糖醇，100 mg·L-1牛血清白蛋白，50 mmol·L-1氯化钾，8 mmol·L-1氯化镁，4 nmol·L-13H标记底物poly（dC）-[3H]poly（rG），1 nmol·L-1逆转录酶。37 ℃孵育30 min后，40 μL反应液点在Whatman玻璃纤维滤纸GF/A上，测定三氯乙酸沉淀的放射性。大黄属样品抑制核糖核酸酶H活性测定使用poly（dC）-[3H]poly（rG）混合物做反应底物，缓冲液体系按操作说明使用，三氯乙酸沉淀的放射性按上述条件测定；结果采用酶活性被抑制一半时化合物的浓度IC50表示，见表1。结果表明，DH2，4，6，14，15，16，19，21的IC50≤0.3 mg·L-1，活性较好；DH1，3，5，7，9，13，18，22的IC50在0.6～0.9 mg·L-1，活性次之；DH8，10，11，12，17，20的IC50≥1 mg·L-1，活性较差。

2.3 大黄属植物UPLC特征图谱研究

2.3.1 色谱条件 Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；温度30 ℃；流速0.3 mL·min-1；进样1 μL；检测波长280 nm；流动相甲醇（A）-0.1%乙酸水（B），梯度洗脱；0～3 min，4%～22% A；3～5 min，22%～27% A；5～6 min，27%～32% A；6～15 min，32%～52% A；15～19 min，52%～75% A；19～21 min，75%～85% A；21～23 min，85%～100% A。

2.3.2 供试品溶液的制备 精密称取大黄样品提取物30 mg，溶于2 mL 50%甲醇中，超声使其充分溶解，0.22 μm微孔滤膜滤过，续滤液存放于-20 ℃冰箱。

2.3.3 UPLC-TOF-MS鉴定主要成分 在同一色谱条件下，UPLC-TOF-MS/MS分析天山大黄（DH10）样品，质谱数据见表2。

2.3.4 样品测定 取各供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1。将色谱图导入Chromap 1.5软件（珠海科曼中药研究有限公司）进行数据处理。以DH4样品色谱图作为参照图谱，利用中位数法进行多点校正生成对照图谱，对出现峰频率75%过滤得到7个共有峰，保留时间分别为2.06，4.31，4.74，6.60，7.99，21.18，22.91 min，其中4个峰被初步指认为：没食子酰基糖苷（2.06 min），儿茶素二聚体（4.31 min），儿茶素/表儿茶素（4.74 min）和芦荟大黄素-葡萄糖苷（7.99 min）。

2.4 谱效相关研究

2.4.1 主成分分析 以22批大黄属样品的UPLC特征图谱为研究对象，采用Chromap 1.5色谱指纹图谱分析系统解决方案软件（珠海科曼中药研究有限公司），将各色谱峰占总峰面积量化作为数据，经过标准化处理后，对数据矩阵进行主成分分析（PCA）。结果表明，前3个主成分贡献率分别为56.59%，20.87%，15.57%，累计贡献率为93.03%。芦荟大黄素-葡萄糖苷（7.99 min），没食子酰基糖苷（2.06 min），6.60 min的3个共有峰为影响3个主成分的主要指标。以前2个主成分绘制的得分图见图2。其中多数活性较差的样品散在分布，活性较好和居中的聚为3个类群，见图2 Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 3个区域。对聚有共有模式和多数样品的Ⅱ类进行进一步谱效相关性分析，以期推测可能的活性成分。

2.4.2 谱效相关性分析 利用SPSS 18.0的双变量相关分析方法处理，2.4.1 项下Ⅱ类样品的各特征色谱峰与HIV-1逆转录酶相关的核糖核酸酶H抑制活性的相关系数。结果表明，儿茶素/表儿茶素（4.74 min），芦荟大黄素-葡萄糖苷（7.99 min）和21.18 min色谱峰与抗HIV-1活性呈正相关，且相关系数大于0.5；2.06 min色谱峰呈负相关。结果提示大黄属样品提取物产生抗HIV-1逆转录酶相关的核糖核酸酶H活性的主要成分可能是儿茶素/表儿茶素，芦荟大黄素-葡萄糖苷和21.28 min色谱峰。

3 讨论

当前，天然产物和植物提取物作为抗HIV先导物的研究是国内外新药研制中非常活跃的领域之一。HIV-1 核糖核酸酶H （ribonuclease H，RNase H） 是逆转录酶上具有自身独特酶功能的催化区域一个区域，近年研究表明阻断RNase H 的活性就可阻断病毒的逆转录过程，因此近年许多研究将其作为独立的作用靶点而进行抑制剂的筛选和设计[4， 6]。本实验针对此靶点对大黄属药用植物进行筛选，结果表明多数提取物都有较好活性。

近年来，中药谱效关系的研究得到了快速发展[7]。谱效关系研究是指对指纹图谱特征的变化（化学成分种类，个数和含量的变化）和药效变化（药效试验或临床效果）采用相关性等化学计量学模型进行分析，建立融化学分析与生物活性评价为一体的综合质量评价体系[8-9]。它揭示了中药所含的化学成分与药效之间的相互关系，阐明了中药可能的活性成分及各成分之间的协同或拮抗作用，可以实现中药内在质量的综合评价和控制，并可指导和加速新药的开发与研究。本实验建立指纹图谱共有模式后，采用共有峰对样品进行主成分分析，结果表明基于共有峰的指纹图谱聚类能在一定程度上表征样品中抗HIV-1核糖核酸酶H活性效应组分的特征信息。而在特征图谱与活性量化数据的基础上，进一步采用皮尔森相关系数法寻找与活性相关性较大的指纹图谱特征峰。结果表明，多酚、蒽醌类成分可能是大黄中的活性成分。已有相关研究表明大黄中蒽醌类化合物及其衍生物具有抑制HIV-1的活性[1，3]，本文的实验结果与文献报道结果一致。大黄属植物中富含蒽醌类成分。我国大黄属植物资源丰富，除了药典记载的正品大黄以外，其他多种大黄属植物在不同地方及民间也做药用。体外抗HIV-1核糖核酸酶H活性筛选和指纹图谱研究结果表明，大黄属的不同产地不同种样品所含化学成分不同，抗HIV-1核糖核酸酶H活性的作用也有显著差异。非正品大黄在抗HIV-1核糖核酸酶H活性方面表现了较好的潜力，特别是四川产的藏边大黄、苞叶大黄和甘肃产的河套大黄，提示大黄属药用植物作为一种潜在的抗HIV资源，值得进一步开发和研究。

[致谢] 意大利卡利亚里大学Tramontano教授在抗HIV-1活性筛选中给予了帮助。

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Spectrum-effect relationship between anti-HIV 1 activities and ultra-

performance liquid chromatography fingerprints of Rheum species

MA Pei， ZHANG Xin-yao， XU Li-jia*， WANG Zhe， XIAO Pei-gen1

（Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Institute of Medicinal Plant Development，

Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine，

Ministry of Education， Beijing 100193， China）

[Abstract] Objective： To study the relationship between ultra-performance liquid chromatography （UPLC） fingerprints of Rheum species and their anti-HIV 1 activities. Method： Twenty two samples of 16 species belonging to genus Rheum from various sources were collected and analyzed in this study. Firstly they were assayed for the HIV-1 reverse transcriptase （RT） associated ribonuclease H （RNase H） activity. Secondly the fingerprints were established by an optimized UPLC method. Sample was analyzed by UPLC-TOF-MS/MS to identify major peaks. The possible relationship between UPLC fingerprints and anti-HIV 1 activities of Rheum species were deduced by mathematical statistics method. Result： Samples of R. austral， R. austral， R. hotaoense exhibited good anti-HIV 1 activities with IC50≤0.2 mg·L-1. The correlation of anti-HIV 1 activities and fingerprints showed that three compounds were the main bioactive components， and their retention times were 4.74， 7.99， 21.18 min， respectively. Conclusion： Compounds in Rheum species with possible anti-HIV 1 activities were deduced by spectrum-effect relationship study. This study supported for study of medicinal plants in Rheum.

[Key words] Rheum species； chromatographic fingerprint； anti-HIV 1 activity； spectrum-effect relationship

doi：10.4268/cjcmm20131503