传染性单核细胞增多症患儿外周血EBV-DNA载量与T细胞亚群的相关性分析

[摘要] 目的 应用流式细胞术检测传染性单核细胞增多症（IM）患者与正常儿童T细胞亚群、Treg细胞的百分比；分析IM患者急性期外周血EB病毒DNA浓度与它们的相关性。方法 选取确诊为儿童传单且外周血EBV-DNA阳性的急性期患者47例，同期正常儿童32例作为对照，比较两组患者外周血T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+及CD4+CD25+、CD4+CD25+CD127-的变化，分析它们与EBV浓度的相关性。结果 IM组患者与对照组相比急性期CD3+、CD8+ T细胞百分比明显上升，CD4+、CD4+/CD8+比值、CD4+CD25+、CD4+CD25+CD127-下降。在急性期IM患者组病毒载量与CD3+、CD8+ T细胞均呈正相关；与CD4+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+、CD4+CD25+CD127-细胞呈负相关。结论 传染性单核细胞增多症患者急性期存在细胞免疫及免疫调节功能紊乱，其免疫功能紊乱的程度与EB病毒感染量有关，为临床IM患儿的治疗提供了理论依据。调节性T细胞在IM患儿急性期减少，可能在IM的发病机制中起了重要的作用。

[关键词] 传染性单核细胞增多症；T淋巴细胞亚群；流式细胞仪；EB病毒DNA；CD4+CD25+CD127-

[中图分类号] R725.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）34-01-02

Correlated Analysis of Epstein-Barr Virus Load and Changes of T Cell Subsets in Children with Infectious Mononucleosis

GUO Juanjuan1 CHANG Hong2 HAO Guoping2 WANG Xiaohuan2 ZHU Lei3

1.Shanxi Medical Univercity，Taiyuan 030001，China；2.Department of Hematology，the Children's Hospital in Shanxi Province，Taiyuan 030000，China；3.Department of Laboratory，the Children's Hospital in Shanxi Province，Taiyuan 030000，China

[Abstract] Objective To measure the expression level of T lymphocyte subsets in children with infectious mononucleosis（IM） during acute phase；To study the correlation of Epstein-Barr Virus load and changes of T cell subsets in children with IM. Methods T lymphocyte subsets and regulation T cells in peripheral blood were measured by flow cytometry in 47 cases with acute infectious mononucleosis. The measured results were compared with that of 32 normal children. Results Compared with the following results in controls，CD3+，CD3+CD8+ were increased and CD3+CD4+，CD4+/CD8+ ratio，CD4+CD25+，CD4+CD25+CD127- were reduced in the IM patients at the acute stage. There was a positive correlation between EBV loaf and CD3+，CD8+ during acute phase. There was a negative correlation between EBV load and CD4+ and CD4+/CD8+ratio，regulation T cells during acute phase. Conclusion There lies the immune dysfunctions in the children with acute infectious mononucleosis. The degree of immune dysfunction is relevant to EBV-DNA copy number. Meanwhile，regulation T cells of peripheral blood in the IM patients was diminished，they possible play an important role in the pathogenesis of IM.

[Key words] Infectious mononucleosis；T lymphocyte subsets；Flow cytometry；EBV-DNA；CD4+CD25+CD127-

传染性单核细胞增多症（IM），是一种由EB病毒感染引起的急性或亚急性全身性疾病[1]，是儿科常见的一种病毒性疾病，临床症状复杂、多样[2]，临床多表现为发热、咽炎和颈淋巴结肿大、肝脾肿大、外周血中会出现异型淋巴细胞等。此病早期症状不典型，诊断较困难，易漏诊或误诊，且往往有多脏器损害情况。因此儿科大夫诊断是非常重要的。临床上通常根据症状及检测EB病毒抗体来确定，近年来关于EB病毒DNA检测在临床上受到重视，有研究表明，EB病毒DNA检测较抗体检测阳性率更高[3]。同时随着免疫学的深入研究，EB病毒对机体免疫功能的影响受到了广大学者的关注，现代研究认为IM患者多有免疫调节功能紊乱，尤其是T细胞免疫功能紊乱。本文旨在通过检测IM患者急性期细胞免疫变化情况及探讨IM患者EB病毒浓度与T细胞亚群及Treg细胞之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

IM患者47例（观察组）均为2010年8月～2011年8月山西省儿童医院收治住院患儿，EBV-DNA均为阳性，诊断以《实用儿科学》第7版中的诊断IM依据，根据临床表现、周围血象和血清血检查确诊[4]。IM组共47例，男22例，女25例，年龄1～12岁，平均4.8岁；对照组为同期儿童保健门诊的正常儿童32例，男21例，女11例，年龄3～12岁。平均5岁，两组儿童性别、年龄的差异均无统计学意义（P＞0.05）。所有患儿既往无免疫低下及过敏性疾病史和过敏性疾病家族史。

1.2 试剂、仪器

T细胞亚群及Treg细胞测定：Optilyse lysing solution（溶血素） CD4-PC5、CD25-FITC、CD127-PE单克隆抗体CD4-FITC/CD8- FE/CD3-PC5三标记单克隆抗体购买于美国贝克曼库尔特有限公司，FC500型流式细胞仪购于美国Coulter公司。

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EBV浓度：EB病毒核酸扩增荧光检测试剂盒购买于中山大学达安基因股份有限公司。美国的ABI-7300实时FQ-PCR仪。

1.3 检测方法

流式细胞术定量检测IM患儿急性期外周血Treg细胞及T细胞亚群，以%表示。取清晨患儿及健康者空腹外周静脉血1mL，EDTA试剂抗凝。每个患者取两个试管，于一支试管中加入5μL三标记单克隆抗体，一支加入5μL的CD4-PC5、CD25-FITC、CD127-PE单克隆抗体，再分别加入20μL抗凝静脉血，充分混匀，室温避光，孵育20min后，加入红细胞裂解液（溶血素）100μL，以1000r/min的速度离心5min，弃上清，生理盐水洗涤1次，最后以500μL的生理盐水悬浮细胞。流式细胞仪检测10 000个淋巴细胞。

EBV-DNA载量检测：采集清晨空腹外周静脉血2mL采用ABI-7300 FQ-PCR仪（实时荧光定量PCR）进行检测，检测步骤、结果判断以及质量控制方法按其公司试剂操作说明进行。检测极限为5×102copies/μL，大于或等于该值为阳性。

1.4 统计学处理

采用SPSS17.0统计软件，检测结果求出均数±标准差，组间比较采用t检验。EBV-DNA含量与T亚群及Treg细胞相关性分析采用Spearman相关分析。

2 结果

2.1 IM组与对照组T亚群及Treg细胞水平比较

与正常对照组相比，急性期IM患儿，CD3+、CD8+明显高于对照组（P均＜0.01），CD4+、CD4+/CD8+比值、CD4+CD25+、CD4+CD25+ CD127-与正常组比较都明显下降，差异有统计学意义（P均＜0.01），结果见表1。

2.2 IM组急性期EBV-DNA浓度与T细胞亚群及Treg细胞之间的相关性分析

相关性结果（表2）表明，在急性期EB病毒载量与CD3+、CD8+ T细胞均呈正相关；与CD4+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+、CD4+ CD25+CD127-细胞呈负相关。

3 讨论

EB病毒被国际癌症研究机构归为Ⅰ类致癌物质。是一种嗜淋巴细胞的DNA病毒，属疱疹病毒属，具有潜伏和转化的特性[5]。感染后多数表现为传染性单核细胞增多症，部分患儿因病情得不到控制，感染可迁延不愈或继发其它恶性疾病[6]，如慢性活动性EB病毒感染、EBV相关的噬血细胞综合征、急性淋巴细胞白血病、T/NK细胞淋巴增生性疾病、淋巴瘤、移植后淋巴细胞增生性疾病等。传单是这种病毒感染最常见的。

近年来IM发病率有逐年上升趋势，而且对此病的研究也越来越多，研究发现[7]IM的发病过程中存在细胞免疫异常情况。其发病机制是EBV感染并在细胞内进行复制，细胞溶解后病毒释放入血液，再感染B淋巴细胞，由于体内B细胞具有EB病毒受体，故B细胞先受累，继而引起T细胞和NK细胞产生大量的细胞因子，活化的B细胞刺激CD8+细胞增殖活化，发展到一定程度的B细胞可与CD8+细胞相互结合而出现凋亡，使淋巴细胞增殖呈自限性变化。所以在限制EB病毒感染的B细胞增殖过程中，CD8+ T细胞起重要作用，而CD4+细胞能促进B、T细胞和其它免疫细胞的增殖和分化，能有效清除EB病毒。因此认为细胞免疫对EBV感染起决定性作用，CD4+/CD8+比值是重要的免疫状态的检测指标，其比例的降低与免疫系统损伤的程度相关[8]。本实验中已经证实IM组患者与对照组相比急性期CD3+、CD8+ T细胞百分比明显上升，提示患儿EB病毒感染后导致机体T细胞发生强烈反应。CD4+、CD4+/CD8+明显下降，显示细胞免疫功能下降。此结果与许多相关研究相一致。

曹晓军等研究提示IM患儿存在免疫调节功能紊乱，致使抗病毒的功能降低，是导致IM患儿病情加重或恶化的重要原因[9]。调节性T细胞是一群具有免疫抑制功能的细胞，其能抑制效应T细胞的过度活化，对维持机体免疫自稳、防止自身免疫发生具有极其重要的作用。近年来有文献报道了Treg细胞的新标志物CD4+CD25+CD127-。同时不少研究表明，此细胞与许多疾病的发病机制相关。国内外关于EB病毒感染者的外周血CD4+CD25+ CD127-的报道很少，为此，以IM为例，本文实验结果显示CD4+ CD25+CD127-细胞在IM患儿外周血中比例明显降低，这表明它可能参与了IM疾病的发病过程。同时还可以看到调节性T细胞与EB病毒浓度呈负相关，可见患儿机体感染EB病毒，Treg细胞在杀伤病毒、维持内环境的稳定中可能发挥了不可忽视的作用。

综上所述，从本实验中结果显示，EBV-DNA浓度与T细胞亚群及调节性T细胞存在相关性，调节性T细胞在EBV感染儿童IM发病过程中，数量减少，提示可能发挥了主要的作用。临床上在使用抗病毒的同时，加用免疫治疗，对疾病的预后和病情评估有帮助。外周血EBV-DNA浓度对传染性单核细胞增多症的诊断价值极高，浓度越高，免疫功能紊乱越重，提示含量与IM的病程密切相关。此两项可以作为判断疗效及检测病情的指标。此实验选择样本为小样本，需要进一步验证。

[参考文献]

[1] 胡亚美，江载芳. 诸福棠实用儿科学[M]. 第7版. 北京：人民卫生出版社，2002：819-827.

[2] 朱易萍，高举，杜惠容，等. 196例传染性单核细胞增多症并发症和实验室检查[J]. 实用儿科临床杂志，2003，18（11）：902.

[3] 苏犁云，徐锦，孙家娥，等. EB病毒感染实验室诊断方法探讨[J]. 检验医学，2006，21（5）：513-516.

[4] 陆华，诸美瞻，胡亚美. 传染性单核细胞增多症[M]. //胡亚美，江载芳.诸福棠实用儿科学. 第7版. 北京：人民卫生出版社，2002：821-825.

[5] 罗晓明，周馥英，周永列，等. 传染性单核细胞增多症B淋巴细胞及其活化状态的研究[J]. 中华儿科杂志，2004，42（9）：701-704.

[6] 郭龙. EB病毒与非肿瘤性重症疾病[J]. 中国实用儿科杂志，2008，23（1）：64-66.

[7] Scherrenburg J，Pirious ER，Nanlohy NM，et al. Detailed analysis of Epstein-Barr virus-specific CD4+ and CD8+ T cell responses during infectious mononucleosis[J]. Clin Exp Immunol，2008，153（2）：231-239.

[8] Yasutomo K. The cellular and molecular mechanism of CD4+/CD8+ lineage commitment[J]. Med Invest，2002，49（1/2）：1.

[9] 曹晓军，倪慧萍. 传染性单核细胞增多症患儿T细胞亚群变化及临床意义[J]. 江苏大学学报，2007，17（5）：429-431.

（收稿日期：2011-09-27）

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