时间：2022-05-17 08:29:05
摘 要：本实验对蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的微生物学特性进行了研究，研究了不同盐浓度，不同pH值，不同温度对蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌生长的影响。采用滤纸片试验研究了壳聚糖保鲜剂和各种自制保鲜剂对蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制效果，同时用臭氧水处理污染了这两种菌的贻贝，结果表明：臭氧水的抑菌效果很好，浓度越高，效果越好。
关键词：蜡状芽孢杆菌；枯草芽孢杆菌；臭氧水；壳聚糖
1 材料和方法
1.1 原料和菌种
贻贝、实验室分离的蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌
1.2 药品和试剂
牛肉浸膏、蛋白胨 、氯化钠 、营养琼脂 、盐酸、氢氧化钠
壳聚糖保鲜剂：10ml冰醋酸+190ml蒸馏水+5g壳聚糖
自制保鲜剂： TZ-27、 TZ-56、 TZ-58、CPD02、CP1、 CP2、ED、 DT
1.3 主要仪器和设备
电子天平、冰箱、电热恒温水浴锅、自动控制压力蒸汽灭菌器、无菌操作台、恒温生化培养箱、臭氧发生器、紫外分光光度计。
其他材料：试管、玻璃棒、烧杯、剪刀、镊子、移液管、洗耳球、培养皿、100ml锥形瓶、300ml锥形瓶、酒精灯、打火机、接种环。
1.4 实验方法
1.4.1 蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌微生物学特性
（1）不同pH对蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的影响
在无菌操作台将蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌进行活化，并在37℃培养箱中培养24h，然后接到营养琼脂液体培养基中，继续培养24h。配置牛肉膏蛋白胨液体培养基，分别调pH至3、5、7、9、11和13，每种pH梯度配置3瓶，每瓶盛装培养液20ml，灭菌备用。分别取每种pH梯度液体培养基2瓶，分别加入0.5ml蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆，在37℃恒温培养箱中培养24h后观察结果。用紫外分光光度计测量其620nm处的吸光度。
（2）不同盐度对蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的影响
在无菌操作台将蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌进行活化，并在37℃培养箱中培养24h，然后接到营养琼脂液体培养基中，继续培养24h。以牛肉膏蛋白胨为基础，把其氯化钠的含量分别调为0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、25%、30%配置培养基，每种氯化钠浓度3瓶，每瓶装20ml，灭菌后，在无菌操作台上进行操作，取2瓶分别接入蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌0.2ml（注：接种蜡状芽孢杆菌的各瓶需调PH6.4-6.5）。一瓶空白对照。将接种的蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌各瓶置37℃恒温培养箱中培养24h后观察结果。用紫外分光光度计测量其620nm处的吸光度。
（3）不同温度对蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的影响
在无菌操作台将蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌进行活化，并在37℃培养箱中培养24h，然后接到营养琼脂液体培养基中，继续培养24h.配置牛肉膏蛋白胨液体培养基12瓶，每瓶装20ml，灭菌。取8瓶分2组，每组4瓶，分别接入蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌，放入25℃、30℃、37℃、40℃的恒温培养箱中培养24h后观察结果。用紫外分光光度计测量其620nm处的吸光度。
1.4.2 臭氧作用[1][2]
臭氧通入水中时间的不同产生不同臭氧水对贻贝中蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的杀菌效果。
1.4.2.1实验方案
贻贝肉灭菌污染测总菌数分装（20g/包）用臭氧水浸泡5min,测总菌数得杀菌效果
1.4.2.2实验步骤
将新鲜的贻贝在1000ml烧杯中煮沸，取出贻贝肉，称取70g放入300ml的烧杯中用报纸包好，放入高压蒸汽灭菌器中灭菌（121℃，20min）。灭菌完成后待冷却，取2-3ml蜡状芽孢杆菌菌悬液加入100ml的无菌水中，混合均匀，将其倒入灭完菌的贻贝肉中，用灭过菌的玻璃棒搅拌均匀。污染几分钟后，将水倒出，用电子天平称取10g贻贝肉进行总菌数的测定。多的肉分装成20g/包，用臭氧发发生器作用水不同时间的3个臭氧水浸泡5min，取出浸泡过的贻贝肉，分别称取10g进行菌数的测量。根据用臭氧作用前后的菌数测量得出臭氧的杀菌效果。
1.4.2.3 测总菌数方法[3]
a.稀释
称取10g贻贝肉装入90ml生理盐水中，上下震荡，10s内震荡25次，制成10倍的稀释液。
b.递增稀释
以无菌移液管移取10倍稀释液1ml与9ml的无菌水试管中，震荡均匀，制成100倍的稀释液。重复此操作，制成1000倍或者更高的倍数稀释液。制备最初稀释液到倾倒培养基的时间间隔不宜超过15min。
c.接种
选择适当倍数的稀释液（10-2、10-3、10-4），移取1ml进入灭菌培养皿中，没一种稀释度接种2个培养皿。
d.倾倒培养基
将冷却至45℃的营养琼脂培养基加入培养皿，厚度为3-4mm混合均匀，静置，冷凝。
e.培养
把制作好的培养皿放入37℃的培养箱中培养48h后取出计数。
f.计数
培养48h后，取出培养培养皿，算出同一稀释度两个培养皿上菌落的平均数，并按下列公式进行计算：每毫升菌落形成单位（cfu）=同一稀释度两次重复的平均菌落数×稀释倍数。
1.4.3 不同保鲜剂对蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的滤纸片试验[4]
打孔器在滤纸上打一些直径为6毫米的圆形滤纸片，放入高压蒸汽灭菌器中灭菌。在无菌情况下，分别吸取10ul蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌悬液至不同培养皿中，用灭完菌的0.5%盐度的牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，每种保鲜剂浸2片滤纸片，贴倒平板上，每个平板贴5片，做好标记，在37℃培养24小时，观察结果，是否有抑菌圈出现，并观察抑菌圈的大小。
2 结果与讨论
1.5 蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的微生物学特性