肺纤方对肺纤维化大鼠肺组织自由基损伤的影响

摘要：目的 观察肺纤方对博来霉素所致肺纤维化大鼠肺组织自由基损伤的影响，探讨其抗肺纤维化的作用机制。方法 144只健康Wistar大鼠随机分成空白对照组、模型组、阳性对照组及肺纤方高、中、低剂量组，每组24只。除空白对照组外，按Szapiel法建立模型，次日灌胃给药，肺纤方高、中、低剂量组（3.2、1.6、0.8 g/kg）均为10 mL/kg，阳性对照组予醋酸泼尼松混悬液（6 mg/kg），空白对照组与模型组予等量生理盐水，1次/d，给药周期21 d。分别在造模7、21 d后分2次取材，前后期各随机杀检10只。测定肺组织谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）的含量。结果 与模型组比较，肺纤方高、中剂量组均可显著升高肺纤维化大鼠肺组织中GSH-Px和SOD的含量（P

关键词：肺纤方；博来霉素；肺纤维化；自由基损伤；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.12.012

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）12-0032-02

Effect of Formula for Lung Fibrosis on Free Radical in Pulmonary Tissue of Pulmonary Fibrosis Rats ZHI Kai-ye， KANG Yong， NI Yan， JI Xin-hua， LU Fang-jin， LI Hui-juan， YUE Yong-hua （Shanxi Traditional Chinese Medical Hospital， Taiyuan 030012， China）

Abstract：Objective To observe the effect of Formula for Lung Fibrosis on free radical in pulmonary tissue in rat model of pulmonary fibrosis induced by Bleocamicina. Methods A total of 144 healthy Wistar rats were divided into six groups randomly， which were blank control group， model group， control group， and high-， medium-， low-dose treatment group of Formula for lung fibrosis， 24 rats in each group. The model was made with Szapiel’s method， and the next day rats were given drug with intragastric administration. The three treatment groups were given high-， medium- and low-dose of Formula for Lung Fibrosis （3.2， 1.6， 0.8 g/kg， which were as 10 mL/kg）， control group was given suspl. prednisone acetate （6 mg/kg， which was as 10 mL/kg）， and blank control group and model group were given normal saline once a day for 21 days. Samples were drawn at the 7th day and 21st day， 10 rats respectively. GSH-Px， SOD， MDA and NO in lung tissue were detected. Results Compared with model group， GSH-Px and SOD increased remarkably in high- and medium-dose treatment group of Formula for Lung Fibrosis （P

Key words：Formula for Lung Fibrosis；bleocamicina；pulmonary fibrosis；free radical；rats

目前研究认为，在特发性肺纤维化（IPF）的发病阶段，上皮细胞和过氧化亚硝酸盐水平显著升高，导致氧化剂和抗氧化剂之间的失衡，可能是导致上皮细胞持续损伤的原因之一。这种失衡可以导致肺泡上皮细胞损伤，促进肺纤维化的发生和发展。因此，调节细胞氧化应激状态可能是治疗IPF的有效方

基金项目：山西省科技厅攻关项目（20090311055-2）

法[1]。肺纤方为山西省中医院肺病科临床探索治疗间质性肺疾病所形成的自拟方，它在防治肺纤维化患者疾病发展、减轻患者呼吸窘迫的痛苦、改善肺组织功能状态等方面有很好的疗效[2]。本实验从抗氧化方面探讨肺纤方抗肺纤维化的作用机制和可能途径，主要观察其对博莱霉素诱导肺纤维化大鼠肺组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量的影响。

1 实验材料

1.1 动物

清洁级健康Wistar大鼠144只，雌雄各半，体质量（200±20）g，山西省中医院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（晋） 2009-10。

1.2 药物与试剂

肺纤方由柴胡、黄芩、党参、法半夏、天花粉、五味子、桂枝、白芍等14味组成。按处方比例由本院门诊药房称取药材，本院中药方剂研究所制备。用蒸馏水配成浓度为1.45、0.73、0.36 g原药材/mL（以浸膏含量计算，相当于人临床日用剂量的15、7.5、3.75倍）肺纤方混悬液。醋酸泼尼松片（天津太平洋制药有限公司生产，批号090707）用蒸馏水配成浓度为0.6 mg/mL（相当于人临床日用剂量48 mg体质量比例的7.5倍）混悬液备用。博莱霉素A5，哈尔滨博莱制药有限公司生产，批号090607，GSH-Px、SOD、MDA、NO及考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供，批号依次为20090721、20090721、20090722、20090722、20090725。

1.3 仪器

UV-260紫外可见分光光度仪（上海精密仪器厂）；TLL-C型低速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；微量加样器（北京青云公司）；恒温水浴箱（北京市医疗设备厂）；AE-160型分析天平（瑞典制造）；混旋器；匀浆器。

2 实验方法

2.1 造模与给药

将动物以20%乌拉坦麻醉后固定，常规消毒，按Szapiel法[3]气管内注射博莱霉溶液5 mL/kg复制模型，术后随机分为模型组、阳性对照组及肺纤方高、中、低剂量组。空白对照组手术操作同模型组，气管内注射等体积生理盐水。次日各治疗组开始灌胃给药，肺纤方高、中、低剂量组给予3.2、1.6、0.8 g/kg混悬液，阳性对照组给与醋酸泼尼松混悬液（6 mg/kg），空白组与模型组给予等量生理盐水。连续21 d。

2.2 标本采集与检测

造模后第7、21日，各组分别随机选取10只大鼠，20%乌拉坦腹腔注射麻醉，固定于大鼠实验解剖台上，剪开颈部皮肤并打开胸腔，剥离气管和肺脏，摘取双肺，放入冷生理盐水中漂洗除去浮血，滤纸吸干后，取右肺下叶适量组织，在冰浴上剪成碎块，加入9倍预冷的生理盐水，冰浴中快速研磨制成10%组织匀浆，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上清液进行测定，-70 ℃冷冻保存。按试剂盒说明书测定GSH-Px、SOD、MDA及NO含量。

3 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行分析，各组数据用―x±s表示，多组间数据比较采用方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

4 结果（见表1）

表1 各组大鼠肺组织中SOD、GSH-Px、NO及MDA含量变化比较（―x±s）

组别 只数 SOD（U/mg） GSH-Px（U/g） NO（?mol/mg） MDA（nmol/mg）

第7日 第21日 第7日 第21日 第7日 第21日 第7日 第21日

空白对照组 10 6.71±1.29 8.34±1.75 20.16±2.73 20.26±3.39 1.88±0.67 1.65±0.57 2.94±0.63 2.26±0.45

模型对照组 10 4.12±0.87 5.43±2.07 10.13±3.09 10.29±4.06 3.97±1.26 2.97±0.83 4.92±1.03 3.98±1.02

阳性对照组 10 6.16±0.69 7.88±1.91 16.05±3.18 17.57±5.29 2.19±0.23 1.98±0.44 3.62±0.89 2.96±0.53

肺纤方高剂量组 10 5.92±1.23 8.06±1.83 17.82±4.98 18.06±3.42 2.36±0.61 1.74±0.50 3.32±0.64 2.72±0.87

肺纤方中剂量组 10 5.65±0.52 7.30±1.73 15.78±3.01 16.25±3.82 2.97±0.59 2.06±0.47 3.87±0.71 2.85±0.68

肺纤方低剂量组 10 5.46±1.25 6.13±0.99 12.06±1.82 12.98±4.36 3.40±0.82 2.36±0.66 4.02±0.59 3.23±0.66

注：与空白对照组比较，P

5 讨论

笔者临床观察发现，IPF主要临床表现为咳嗽、咳吐浊唾涎沫、气喘胸闷、情绪微烦、口苦、咽干、头晕头痛、多汗、纳差，或伴有发热，或伴有恶心呕吐，舌红苔厚，脉弦或弦细。仔细分析这些症状，发现既有少阳证的表现，又兼有太阳证的表现。因此肺纤方的药物组成涉及中医六经辨证用药的太阳和少阳。方中以柴胡为君药，黄芩为臣药，柴胡之升散，得黄芩之降泄，二者相伍，是和解少阳的基本结构。邪从太阳传入少阳，源于正气本虚，故用桂枝祛太阳之邪，用党参、大枣益气健脾，后二者一来可以扶正以驱邪，二来可益气以抵御邪气内传，使正气旺盛，则邪无内传之机。五味子、干姜温肺散寒，则咳喘自止，痰涎自化；瓜蒌仁宽胸理气，则胸闷得除；天花粉、桔梗利咽，则咽干得解；炙甘草助党参、大枣扶正，并能调和诸药。诸药合用，具有祛除外邪、平调寒热、宣肃肺气、止咳平喘的功效。临床观察显示，肺纤方对于间质性肺疾病尤其是IPF有明显的治疗作用，在改善症状、提高患者生存质量、延长生命方面显示出独特的优势[3]。

生理条件下，机体内抗氧化酶系如SOD、GSH-Px及一氧化氮合酶（NOS）能及时调节和清除自由基。氧自由基如果释放过多，或机体清除氧自由基能力下降，就会损伤组织细胞，而肺脏是易受损的靶器官之一，在肺纤维化发病过程中，存在着下呼吸道氧化/抗氧化失衡。因此，在寻求治疗肺纤维化有效药物的研究中，增强机体的抗氧化能力，尤其是清除氧自由基的能力，已成为衡量疗效的标准之一。

SOD能清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基，是机体有效清除活性氧的重要抗氧化酶类之一，被称为生物体抗氧化系统的第一道防线，其活性增加，可阻止氧自由基的连锁反应，清除氧自由基，保护细胞免受损伤，因此它可以反映机体清除氧自由基的能力。

GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要 （下转第36页）