白血病中树突状细胞疫苗的免疫治疗

摘要：急性髓系白血病（AML）中表达白血病相关抗原（LAAs）的白血病细胞来源的树突状细胞（DC）及负载LAAs的正常单核细胞来源的DC，均能有效诱导肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）反应，有望在治愈AML中发挥重要作用。本文就AML中DC疫苗的培育、分子标记的测定、功能的检测作一介绍。总结DC疫苗治疗AML临床研究的新进展。

关键词：白血病，髓样，急性；树突细胞；免疫疗法；疫苗

急性髓系白血病（AML）是白血病干细胞癌基因转化而来的造血干／祖细胞的恶性肿瘤。尽管大多数患者在标准化疗方案的诱导下能够达到完全缓解，但复发率仍很高。造血干细胞移植是目前最有效的治疗手段，但也存在微小残留引起移植后复发的问题。因此，急需寻找更有效的肿瘤治疗方法，进而消除微小残留病灶，减少白血病复发。以树突状细胞为代表的细胞免疫治疗有望成为治疗肿瘤新方法，与其他免疫治疗方法相比，树突状细胞（DC）免疫治疗的特点主要有主动性免疫、特异性好、持续时间长，能够针对性地消灭肿瘤干细胞或残存肿瘤细胞，发挥强大的抗肿瘤免疫效应［1］。在缓解后AML患者外周血单核细胞（MO）中分离得到正常DC（MO－DC），其不表达白血病分子标志，承载白血病相关抗原后，可有效诱导肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）对白血病细胞的杀伤作用。在AML中白血病细胞可以直接分化为DC（AML－DC）。这些白血病来源的DC可以表达白血病抗原（LAAs），有效诱导CTL对自身肿瘤细胞杀伤作用。根据这一原理设计的AML－DC及MO－DC疫苗正在进行临床Ⅰ／Ⅱ期试验。

1AML患者中DC的来源及体外培养

1．1DC的来源

采用流式细胞术四色射门方法检测AML患者中DC的表达，结果显示，69％的初治AML患者发病时检测不到髓样树突状细胞（mDC）和浆样树突状细胞（pDC），剩余31％的AML患者DCs水平是正常的或者升高的，在缓解后mDC水平可以恢复，而pDC水平相对较低；研究表明mDC升高或正常的AML－M4／M5较AML－M2／M3患者较常见，而pDC无此区别［2］。已知单核细胞和DC有共同的前体细胞，而AML－M4／M5的发病机制是单核前体细胞恶性病变，突变的细胞可能是分化为巨噬和树突状细胞前体细胞的细胞，存在向DC分化的潜能，提示DC来源于白血病细胞。研究表明Fms样酪氨酸激酶（FLT3）内部串联重复序列（ITD）突变阳性的大多数AML患者的mDc和pDC水平明显高于ITD突变阴性者，从ITD＋患者分离所得mDC和pDC均为ITD突变阳性，在体外培养后获得DC形态，说明其为AML－DC［3］。AML患者完全缓解后分离的外周血MO－DC，用FISH技术（FISH）或者聚合酶链反应分析表明DCs无白血病标志，说明其来源于正常前体细胞，对自体白血病细胞有细胞毒性［4］。AML患者外周血上清液可降低MO－DC的分化成熟及细胞凋亡。说明AML发病时，MO－DC数量减少，AML－DC增多；研究表明，AML患者完全缓解后mDC水平可以恢复［2］。推测可能为正常前体细胞来源DC增加。Danilov等［5］研究表明血管紧张素转换酶（即CD143）在MO－DC上高表达，而在AML－DC上的表达较低，是第一个能够区分AML患者DC来源的分子标记。

1．2AML－DC的体外培养

AML－DC未培养时对自体AML细胞无明显的杀伤活性，经细胞因子培养成熟后的AML－DC可诱导效应T细胞对自体AML－DC有效杀伤。体外培养时，不同的细胞因子组合诱导AML－DC成熟，其成熟状态有一定的差异。AML－DC来源于AML白血病细胞，具有正常DC的典型形态、表型和功能。目前，AML白血病细胞培养不能全部获得AML－DC。Santiago－Schwarz等［6］第一次使用肿瘤坏死因子（TNF）、粒细胞巨噬细胞刺激因子（GM－CSF）、干细胞因子（SCF）及白介素（IL）6体外培养1例AML患者白血病细胞24小时后，其可分化为AML－DC。目前AML患者白血病细胞分化为AML－DC的最佳体外培养方案为重组GM－CSF联合重组IL－4，0．7×106的白血病细胞在0．7～1ml的血清培养液中培养6天后可获得约0．3×106的成熟AML－DC，回收率约28％～50％［7］。

1．3AML－DC的分子标记检测

AML－DC具有AML患者白血病细胞的肿瘤相关抗原，且可递呈抗原。体外诱导成熟的AML－DC具有DC的形态，使用相差显微镜观察，其胞体较诱导前明显增大，呈不规则形或树枝状突起。透射电子显微镜下，可见不规则形细胞核，位于胞浆一侧，胞浆丰富及充分发育的高尔基体，且表达Ⅱ型主要组织相容性复合体（MHC），是典型的成熟DC型态［8］。由AML患者白血病细胞培养所得的未成熟AML－DC较白血病细胞中CD14低表达，CD1a和人类白细胞DR抗原（HLA－DR）高表达；而CD11c，CD40和CD86无明显差异［8］。AML－DC成熟后较白血病细胞高表达CD83，CD86，CD40，CD11c，CCR7和HLA－DR，CD14表达下调，CD1a和Toll样受体（TLR）表达无明显区别［8－9］。

2AML患者中DC的功能

2．1AML患者不成熟

DC的功能不成熟DC的主要功能为捕捉抗原。DC通过表面表达的c型凝集素样受体、TLR和螺旋酶等模式识别受体识别坏死的肿瘤细胞，且化疗可增强DC识别肿瘤抗原的能力。不成熟DC主要在骨髓和淋巴结中捕捉AML抗原，AML肿瘤细胞及胞外细胞因子可影响DC捕捉抗原功能。死亡的肿瘤细胞可以被DC捕捉，肿瘤细胞有坏死、凋亡、衰老和自吞噬，其中凋亡细胞影响DC的吞噬和处理，通过表达3种信号，即“发现我”，“吃掉我”和“别吃我”［10］。对于坏死细胞，DC可识别坏死细胞暴露的胞内成分而进行吞噬递呈。目前不成熟DC对肿瘤自吞噬细胞和衰老细胞的抗原递呈尚不清楚。

2．2AML成熟DC的功能

2．2．1成熟DC递呈抗原的性质AML白血病细胞来源的AML－DC表达LAA。正常细胞来源的DC无白血病抗原，故需要负载AML抗原，负载的抗原包括AML多肽、AML细胞溶解残余物、AML细胞所有RNA、凋亡的白血病细胞。有研究报道白血病凋亡滤泡是MO－DC最佳负载抗原，可有效激活CD8＋T细胞，增强对肿瘤细胞的杀伤作用［11］。Li等［12］应用实时定量聚合酶链反应检测AML－DC的3种白血病抗原表达，即黑色素瘤特异性抗原（PRAME），透明质酸介导的运动受体（RHAMM）和wilm肿瘤蛋白1（WT1），结果显示，15例AML患者的AML－DC表达至少一种LAA，且其在AML－DC上较白血病细胞表达高。应用实时定量聚合酶链反应检测AML－DC较白血病细胞LAAs表达水平变化，结果显示7／12患者AML－DC上PRAME表达上调，6／12患者AML－DC上RHAMM表达上调，2／12患者AML－DC上WT－1表达上调，1／12患者AML－DC上蛋白酶－3表达上调，所有样本至少高表达一种LAA；采用流式细胞仪观察，AML－DCs与AML白血病细胞相比，CD40和CD80表达明显上调，RHAMM、PRAME蛋白阳性［13］。2．2．2成熟DC的功能Nourizadeh等［7］研究报道15例AML患者中11例患者白血病细胞可分化为DC，其中大多数为M4、M5型，且AML－DC的平均回收率为42％，与上述研究报道相符。未成熟AML－DC经Toll样受体4和Toll受体7／8联合刺激后可更好的成熟，成熟的AML－DC经趋化因子介导，向淋巴结迁移，进而更有效的刺激T细胞免疫反应［7］。在体外，Toll样受体激动剂活化的AML－DC可促进共刺激分子表达，大量分泌IL－12，增强TH1型反应，且能强效诱导特异性CTL靶向杀伤肿瘤作用［8］。

3AML成熟

DC诱导的免疫反应的增强选择最恰当的DC疫苗佐剂能够减少疫苗接种数量、确保其对病原的快速反应、减少所需抗原数量、增强自身抗体免疫反应及确保其对特异性抗原最有效和适当的免疫反应［14］。

3．1AML－DC的免疫反应的增强

Brady等［15］研究表明用细胞转染方法敲除AML－DC的信号转导与转录激活因子基因3（STAT3），可以增强AML－DC的免疫原性，增加T细胞的增殖及分化，用三氧化二砷（ATO）抑制AML－DC中STAT3的活性，可上调共刺激分子的表达，促进AML－DC的成熟，其诱导T细胞活化作用增强，IL－12p40分泌增加，增强CD8＋T细胞对白血病细胞的杀伤作用。研究报道，锌指蛋白A20负性调节AML－DC的成熟及其免疫刺激效应，估下调AML－DC中的A20或使其变性，可增强AML－DC的分化成熟，并通过核转录因子κB（NF－κB）信号同路，诱导自体CTL对AML肿瘤细胞特异性杀伤效应［16］。在体外，TNF－α，脂多糖及TLR激动剂联合刺激AML－DC成熟，可很大程度上增强AML－DC的抗原递呈作用，CTL释放干扰素－γ增多，增强CTL对AML白血病细胞的清除作用［17］。体外应用佐剂能够进一步强化AML－DC诱导的免疫反应。Houtenbos等［18］研究报道，在AML－DC与自体或异体T细胞共培养中，加入4－1BBL蛋白可上调共刺激分子的表达，促进CD8＋T细胞的增殖及其对白血病的细胞毒作用，诱导干扰素－γ高表达的TH1型反应，显著增加WT1特异性T细胞，增强T细胞介导的淋巴细胞群对白血病细胞的溶解作用，表明在AML－DC治疗AML中，4－1BBL是一种增强AML－DC诱导T细胞免疫反应的有效佐剂。Schmitt等［19］用定量聚合酶链反应检测到AML－DC高表达TLR2／4，低表达TLR9，加入TLR2配体微生物肽聚糖及脂磷壁酸、TLR4的配体脂多糖和TLR9配体寡核苷酸后可增加TNF－a和IL－6的分泌，促进TH1型反应，加强AML－DC疫苗对肿瘤的杀伤效应，说明微生物配体是增强AML－DC疫苗作用的有效佐剂。已知带有甘露糖敏感血凝菌毛的铜绿假单胞菌可促进AML－DC的成熟，抑制初始T细胞向调节性T细胞分化，增强AML－DC对调节性T细胞的抑制作用，从而增强机体的抗白血病作用，可作为AML－DC疫苗的免疫佐剂。

3．2MO－DC免疫反应的增强

通过使用有效免疫佐剂增强MO－DC的免疫反应效应，MO－DC可更有效发挥抗肿瘤作用，有效清除肿瘤细胞，改善自体免疫功能。研究报道在体外用RNA电穿孔法使MO－DC生成IL－15，IL－15上调NK细胞的膜分子活性，NK细胞分泌干扰素－γ、颗粒霉素B及穿孔素增加，NK细胞对肿瘤细胞的敏感性及杀伤能力增强［20］。因此，在临床应用中使用免疫佐剂增强MO－DC免疫功能后，可减少使用疫苗的数量，从而可减少使用疫苗后的临床不良反应。

4AML临床中应用的DC疫苗

DC疫苗已进行临床Ⅰ／Ⅱ期试验。临床上使用免疫佐剂可有效增强DC疫苗的抗肿瘤效应，明显改善非M3型AML患者的预后（图1）。造血前体细胞来源DC和MO－DC可皮下或静脉给药，因其趋化到淋巴组织的能力强，而AML－DC趋化到淋巴组织的能力弱，估需要直接注射到淋巴结。AML－DC冻存长达21个月后仍然有效［21］。研究报道AML－DC疫苗用于临床实验治疗非M3型的AML患者，3例患者在5．5～13个月期间保持病情稳定，2例患者病情迅速进展死亡，未观察到不良反应［21］。研究表明，在临床实验中MO－DC疫苗与AML－DC疫苗相比，能更有效活化AML患者中的肿瘤特异性T细胞的免疫反应［。新一代的MO－DC疫苗是由Toll样受体在3天内诱导成熟的，并且载有白血病相关抗原WT1蛋白及PRAME，从而诱导AML特异性的T细胞的免疫反应，已用于缓解后复发AML患者的Ⅰ／Ⅱ期临床实验［22］。研究表明在AML患者中有一种特异的DC亚型DC8a，可靶向先天免疫系统，改善免疫耐受，靶点为Toll样受体、CD47及STAT3，提示在先天免疫水平上，可抑制肿瘤细胞的免疫逃避，从而有益于患者［23］。

5结语

虽然DC的研究已经很深入，尤其是在体外的研究，但是仍然存在很多问题及不足，尚需进一步研究。我们还需探讨决定DC成为耐受型或免疫原性DC的具体机制；准确评估临床实验DC疫苗的安全性；探索临床应用中安全有效的DC疫苗剂量，密切注意尚未观察到的临床不良反应。对这些问题的深入研究将很大程度提高DC在AML免疫治疗中的临床应用，降低患者的复发及病死率。

作者：周文 李莉娟 王文媛 许丽丽 张连生 单位：兰州大学第二临床医学院 兰州大学第二医