复方斑蝥注射液对小鼠H22肿瘤细胞Caspase-3蛋白表达的影响

摘 要目的：观察复方斑蝥注射液(Compound Cantharis Injection,CCI)对小鼠H22肿瘤细胞Caspase-3蛋白表达的影响。 方法：采用免疫组织化学的方法检测该药对小鼠H22肿瘤细胞Caspase-3蛋白表达的影响。结果：免疫组织化学结果显示，与模型组比较，CCI能上调Caspase-3蛋白表达(P

关键词复方斑蝥注射液；H22；Caspase-3；蛋白表达

AbstractObjective：To observe the protein expression of caspase-3 in H22 tumor cells by treatment of Compound Cantharis Injection(CCI). Methods：By immunohistochemistry staining the Caspase-3 protein expression in H22 tumor cells was detected.Results：CCI could obviously increase the Caspase-3 protein expression in H22 tumor cells(P

Key words Compound traditional chinese of cantharis injection；H22；Caspase-3；protein expression

细胞凋亡与肿瘤的发生有非常密切的关系，细胞凋亡的减少是肿瘤发生发展的重要因素[1]。目前，有关中药诱导肿瘤细胞凋亡的研究主要集中在分子调控机制等方面。前期实验研究结果表明，CCI可能通过上调Fas蛋白表达，诱导肿瘤细胞凋亡而抑制H22肿瘤细胞的生长。笔者在本实验中通过采用免疫组化方法测定Caspase-3的蛋白表达，从而为全面阐释CCI诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制提供依据。

1实验材料

1.1 实验动物

健康清洁级（SPF）昆明小鼠，贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（黔）2002－0001，体重18g～22g，常规饮食。

1.2 实验药物及试剂

CCI：由贵州益佰制药股份有限公司提供。批号：051215；规格：每支10ml，每1ml相当于0.603g生药。Caspase-3免疫组化试剂盒：武汉博士得生物工程有限公司；DAB显色试剂盒：武汉博士得生物工程有限公司；

1.3肿瘤细胞株及其来源

小鼠肝癌H22：中科院上海细胞研究所。

2实验方法

2.1 建立小鼠实体瘤模型[2]

无菌操作抽取小鼠腹腔内传代8～10天的H22瘤液，用生理盐水(NS)稀释调整瘤细胞数为1×107/ml的细胞悬液，充分混匀。取同性别小鼠40只，消毒小鼠右前肢腋窝部位，分别于每鼠右腋皮下接种瘤细胞悬液0.2ml/只。

2.2动物分组及给药

小鼠接种24小时后按体重随机分为4组：模型组(等容积NS) 、CCI高剂量组(9.45g/kg)、CCI中剂量组(4.72g/kg) 、CCI低剂量组(2.36g/kg)，每组10只，每日腹腔注射给药1次，每次0.15ml/10g体重，连续给药7d。接种后第8天，称体重后处死小鼠，剥离皮下瘤块称重，取出瘤块，10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片。

2.3免疫组织化学的方法检测蛋白表达

免疫组织化学的方法采用SABC法，其操作步骤如下：石蜡切片常规脱蜡至水；置入3%H2O2中10分钟以灭活内源性酶；将切片浸入微波修复液中，微波炉加热至沸腾后断电10分钟，重复两次；然后滴加5% BAS封闭液，室温20分钟；滴加一抗（Caspase-3按1：100用PBS稀释），4℃过夜；滴加生物素化山羊抗小鼠IgG；滴加SABC,37℃20分钟；滴加50μl DAB液，显色20分钟左右。脱水，透明后封片，显微镜下观察。

2.4 结果判定

以胞浆或胞膜中出现棕黄色颗粒为阳性表达细胞。400倍光学显微镜下观察，随机选取5个视野，每个视野观察100个细胞中阳性表达细胞的个数，求平均值，并由此计算出阳性表达率。

2.5数据分析与处理

实验数据均以均数X±S标准差 表示，采用SPSS11.5统计软件，组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）中的LSD方法，P

3结果

与模型组比较， CCI各剂量组肿瘤细胞浆或胞膜中Caspase-3蛋白的表达增多，其中CCI高、中剂量组Caspase-3蛋白的表达明显增多，差异显著（P

4讨论

癌症是一种癌基因激活和抑癌基因失活的基因病，但肿瘤细胞的形成及其恶性表型的维持并不是由单个基因决定的，它涉及多个基因及其相互间调控。Caspase是在细胞凋亡中起作用的一组同源性蛋白, Caspase-3的活化在细胞凋亡信号转导过程中起核心作用,是细胞凋亡过程中激活的关键蛋白激酶和主要效应因子[3] 。大多数触发细胞凋亡的因素,均需通过Caspase-3介导的信号传导途径导致细胞凋亡[4]。已经证实，Caspases-3是 Fas 介导死亡信号途径下游1个关键效应组分[5]，死亡信号诱导复合体 (death inducing signaling complex，DISC)联合高效的激活其下游的影响因子Caspase-3, 导致凋亡最终步骤的执行 [6.7]。

在本研究中，经SABC法光镜下观察H22肿瘤细胞结果显示：CCI剂量组肿瘤细胞浆中Caspase-3蛋白的表达较模型组有所增加，其中CCI高、中剂量 Caspase-3蛋白的表达明显增加，差异显著（P

参考文献

[1]tsujitani S.Apoptosis cell death and its relationship to carcinogenesis in colorectal carcinoma.[J].Cancer,1996,77:1711.

[2]徐叔云.药理实验方法学（第三版）[M].北京: 人民卫生出版社，2002:1430,1436,1766.

[3]Raff M.Cell suicide for beginners.Nature1998,396:119-122.

[4]Thornberry NA.Caspases:enemies within.Science 1998,281:1312-1316.

[5]Cryns V. Protease to die for Genes and Dev[J],1998,12:1551-1570.

[6]Donepudi M,Mac Sweeney A.Insights into the regulatory mechanism for Caspase-8 activation[J].Mol Cell 2003,11:543-549.

[7]欧 阳 高 亮 . 细 胞 凋 亡 与 肿 瘤 的 发 生 发 展 和 治 疗[J].国外医学- 肿瘤学分册,2000,27(5):545-551.

附图1

作者简介：张建武男 ，籍贯：山东济南 ，最高学历：硕士研究 生 ，职称：助教，研究方向：肿瘤药理学。

陈斗佳男 ，籍贯：贵州遵义，最高学历：硕士研究 生，职称：住院医师，研究方向：血液内科学。

唐艳 女，籍贯：四川成都 ，最高学历：硕士研究生（在 读），职称：住院医师，研究方向：生殖内分泌 。