两型TNF―α及其受体在胸主动脉缩窄诱导压力负荷心肌肥厚小鼠中的表达

[摘要] 目的 检测压力负荷所致心肌肥厚小鼠模型心肌组织中两型TNF及其受体的表达。 方法 使用野生型BALB/c小鼠，将其分为假手术组（n=10只）和手术组（n=8只），通过胸主动脉缩窄术诱导压力负荷性心肌肥厚模型。术后2周处死小鼠，并对小鼠进行心脏形态学、血流动力学检测；使用Western Blot方法对心肌组织中两型TNF-α及其受体表达进行检测。 结果 （1）在BALB/c小鼠中成功建立胸主动脉缩窄诱导心肌肥厚模型；（2）术后2周手术组小鼠心脏组织中可见分泌型TNF-α和跨膜型TNF-α表达量均有增加，且分泌型TNF-α表达量明显高于跨膜型TNF-α，差异有统计学意义（P

[关键词] 跨膜型肿瘤坏死因子-α；分泌型肿瘤坏死因子-α；肿瘤坏死因子受体；压力负荷性心肌肥厚

[中图分类号] R-332 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）20-09-04

[Key words] Transmembrane TNF-α； Secreted TNF-α； TNF-α receptor；Pressure-overload hypertrophy

心力衰竭发生发展的过程是一个伴随慢性炎症反应发生发展的病理过程。心力衰竭患者体内常伴有多种炎症相关细胞因子的高表达，通过影响心肌收缩力，引起心肌肥大，诱导心肌纤维化、凋亡和心脏重构，进而促进心力衰竭的发生发展。其中，肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor

alpha，TNF-α）是众多炎症因子的关键分子之一[1]。早期研究证实TNF-α通过多种途径在心肌肥厚和心力衰竭过程中扮演着重要的角色。虽然在大鼠和小鼠的心力衰竭模型中证实抗TNF-α抗体的抗心力衰竭作用是有效的，然而，在随后开展的TNF-α拮抗剂治疗心力衰竭大规模临床试验中却没有获得理想的结果，甚至还提高了心力衰竭患者的住院率和死亡率[2]。因此，对TNF-α及其受体进行更深入、细致的研究对于了解TNF-α及其受体在心力衰竭中的作用机制具有重要意义。本实验旨在通过建立胸主动脉缩窄诱导心肌肥厚模型检测两型TNF-α：即分泌型肿瘤坏死（Soluble Tumor Necrosis Factor-α，sTNF-α），和跨膜型肿瘤坏死因子（Transmembrane Tumor Necrosis Factor-α，tmTNF-α）及其两种受体：肿瘤坏死因子受体1（Tumor Necrosis Factor Receptor 1，TNFR1）和肿瘤坏死因子受体2（Tumor Necrosis Factor Receptor 2，TNFR2）的表达情况，从而为后期研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6～8周龄BALB/c野生小鼠购自于华中科技大学同济医学院实验动物中心，实验动物适应性喂养1周后，随机分为2组，每组10只小鼠，分别为：假手术组和手术组。室温22～26℃，相对湿度50%～80%，每日光照12 h，给予标准饲料饮食，自由进食与饮水。所有的实验动物操作程序均符合NIH制定的实验动物管理与使用指南的标准。

1.2 压力负荷性心力衰竭小鼠模型建立

小鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉后，取仰卧位固定。气管插管接呼吸机，控制潮气量2～3mL，呼吸频率90～110次/min。剪毛后用碘氟消毒手术区域，以左侧第二肋为中心在小鼠胸前行纵行切口剪开皮肤，钝性分离肌肉组织，断第二肋。使用开胸器撑开纵膈，分离胸腺，暴露主动脉弓。在右颈总动脉分出大约3mm并用7个零的丝线绕在主动脉弓处，用27g钝性针头放置于丝线和主动脉弓之间垫扎，以认为制造出70%左右狭窄。确认结扎后抽出针头，逐层关闭纵膈。待小鼠自主呼吸恢复后，拔出气管插管，放入饲养笼内饲养。假手术组过程同手术组，只是不进行主动脉弓结扎。术后行小鼠心脏超声和心功能检查，确认造模成功。

1.3 小鼠心脏超声检测

小鼠超声影像检测在上海复旦大学医学院附属中山医院心血管实验室进行。使用仪器为配有30MHz高频探头的VisualSonic Vevo770型超声仪（VisualSonics Inc.，Toronto，ON，Canada）。在使用异氟烷麻醉小鼠后，沿仰卧小鼠胸骨旁左室肌水平短轴和长轴切面采集左室图像，同时在二维图像引导下分别获取5个以上连续心动周期M型超声影像。根据采集影响使用软件分析结果，分别得到心率（heart rate，HR），左室收缩末容积（LV end-systolic internal diameter，LVIDES），左室舒张末容积（LV end-diastolic internal diameter，LVIDED），左室后壁厚度（posterior end-diastolic wall thickness，PWT），室间隔厚度（interventricular septal thickness，IVS），射血分数（LV ejection fractions，EF），左室缩短分数（fractional shortening，FS）等数据。

1.4 小鼠心脏功能检测

按照说明书使用美国Millar Instrument公司PowerLab MPVS-300（Millar Pressure-Volume System）仪器和软件检测和分析小鼠心功能。首先给予小鼠腹腔注射戊巴比妥50mg/kg进行麻醉，固定小鼠，去毛并消毒手术区域，取颈部正中切口剪开皮肤后，逐层钝性分离组织，暴露并游离右颈总动脉约1cm。使用手术线将颈动脉远心端进行结扎，小鼠动脉夹夹闭颈动脉近心端。在显微镜下用显微剪沿颈总动脉以45度角剪开缺口，将前端带有电极的P-V导管（SPR-839，Millar Instruments，Houston，TX）经右颈总动脉缺口插入主动脉并延伸至左心室。通过压力-容积传导系统（Millar Instruments）记录压力-容积环图形。连续记录15min，以获得稳态的血流动力学数据。经pressure-volume analysis分析软件（PVAN）处理后，获得心率（heart rate，HR）、左室收缩末压（LV end-systolic pressure，ESP）、左室压力最大上升速率（maximal rates of rise of ventricular pressure，dP/dt max）和左室压力最大下降速度（maximal rates of decline of ventricular pressure，dp/dt min）等血流动力学数据。

1.5 Western Blot检测心肌组织目的蛋白

用冰PBS漂洗后加入组织裂解液（1%NP 40，0.15% 脱氧胆酸钠，1%SDS，1%PMSF），用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。加热变性、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、5% 脱脂奶粉封闭1小时，以1250浓度的TNF抗体4℃孵育过夜。TBST洗膜后，二抗温育1h，ECL显色，曝光。采用Gel-pro软件系统分析目的蛋白的表达量。

1.6 统计方法

使用SPSS13.0统计学软件处理，数值用（）表示，结果之间分析使用t检验，P

2 结果

2.1 野生型Babl/c小鼠压力负荷性心肌肥厚模型的建立

首先使用野生型Babl/c小鼠进行胸主动脉缩窄手术，制作压力负荷性小鼠心肌肥厚模型。在术后2周进行心脏形态学和血流动力学检测。由图1可见，胸主动脉所致心肌肥厚模型手术组小鼠心脏外观（在体）较假手术组小鼠有明显增大。手术组心脏体重（4.083±0.290）mg/g，相对于假手术组（5.19±0.52）mg/g，也明显升高（图1）。

超声心动图（图2）显示手术组小鼠左室舒张末期内径（3.02±0.80）mm，小于假手术组小鼠（3.31±1.10）mm，手术组左室后壁厚度（0.76±0.01）mm大于假手术小鼠（0.67±0.02）mm。在射血分数和缩短分数方面，虽然手术组均值低于假手术组（Sham：EF：83.16%±1.90%，FS：52.53%±1.60%；TAC：EF：80.91%±2.10%，FS：51.03%±2.10%），但差异无统计学意义。

处死小鼠前使用Millar导管检测心脏血流动力学改变，结果如表1显示：假手术组与正常组在心率无明显差异。左室舒张末期压力（LVEDP）手术组明显高于假手术组[Sham：（5.48±0.15）mm Hg，TAC：（12.227±0.310）mm Hg]，但是在反应心脏收缩舒张功能的左室压力变化最大速率（dP/dtmax）和左室压力变化最小速率（-dP/dtmin）两项指标中，手术组[dP/dtmax：（5627±193）mm Hg/s，-dP/dtmin：（4427±225）mm Hg/s]明显低于假手术组[dP/dtmax：（7127±312）mm Hg/s，-dP/dtmin：（6115±358）mm Hg/s]。

表1胸主动脉缩窄术后2周，假手术组与手术组血流动力学指标。自上而下依次为：心率；左室舒张末压力；左室压力最大上升速率；左室压力最大下降速率。通过以上实验结果，证实胸主动脉缩窄术可以在2周时诱导明显压力负荷性心肌肥厚，增加室壁厚度，减少左室内径和容积，降低心肌收缩/舒张功能。接下来的实验都以2周作为心肌肥厚时间点进行相关检测。

2.2 野生型Babl/c小鼠在压力诱导心肌肥厚时TNF-α受体的表达情况

通过提取心脏组织蛋白进行Western Blot检测压力诱导性心肌肥厚小鼠心脏组织中两种TNF-α受体表达，从而了解在心力衰竭初期TNF-α受体变化情况。结果显示，假手术组TNFR1和TNFR2表达量均很低，而在手术组小鼠心脏组织中TNFR1和TNFR2表达量都明显高于假手术组，但TNFR1表达要高于TNFR2。见图3。

2.3 野生型Babl/c小鼠在压力诱导心肌肥厚时两型TNF-α表达情况

Western Blot检测心脏组织中两型TNF-α：tmTNF-α和sTNF-α表达情况。由图4可见，假手术组中两型TNF-α表达量均较低，TAC术后2周两型TNF-α表达量均较假手术有明显增加，但sTNF-α表达较tmTNF-α表达量更多。

3 讨论

胸主动脉缩窄术可以成功模拟慢性压力负荷性心力衰竭，与人类慢性高血压导致的慢性心力衰竭的病理生理过程相似。胸主动脉缩窄术建立是经典的压力超负荷慢性心衰模型，其机制是通过缩窄主动脉弓，使主动脉压力升高，心脏后负荷增加，心肌代偿性肥厚，后期出现心脏容积增加、心脏扩大，最终心脏失代偿发展为心力衰竭。文献报道胸主动脉缩窄术后2～3周可出现代偿性心肌肥厚，主要表现为室壁增厚，心室腔减小，心脏收缩功能甚至增加；而到后期（术后4～6周）则会出现室壁厚度降低、心室腔扩大、收缩舒张功能降低等心力衰竭表现。本实验通过该手术方式造成一定程度胸主动脉缩窄，术后2周通过心脏超声及心功能检测证实，成功建立了慢性心肌肥厚模型。

TNF-α是重要的免疫调节因子，是最早被发现具有杀伤肿瘤作用的细胞因子之一。1998年Kriegler等[3]发现除sTNF-α以外，还存在tmTNF-α。目前关于两型TNF-α研究仍多集中于sTNF-α，而对tmTNF-α的作用研究较少且多集中于肿瘤方面的研究。例如：tmTNF-α比sTNF-α杀伤肿瘤的种类更广泛，且可以杀伤对sTNF-α耐受的肿瘤细胞等[4]。TNF的受体包括TNFR1和TNFR2，二者胞外段结构相似，但胞内段却截然不同，故介导不同的生物学效应[5]。sTNF-α的主要生物学效应由TNFR1介导，而tmTNF-α对TNFR2的亲和力明显高于sTNF-α，这可能是两型TNF-α生物学活性不同的重要原因[6-7]。

目前TNF-α及其受体在心力衰竭方面研究更多的是sTNF-α和TNFR1，而对于tmTNF-α和TNFR2在慢性心力衰竭中的作用和机制的研究还非常有限。在心脏特异性高表达tmTNF-α转基因小鼠中，心肌横断面积和心肌胶原含量都会增加，从而发展为向心性心肌肥厚。然而，在心脏特异性高表达sTNF-α转基因小鼠中，则会发展为左室扩大，心肌胶原含量减少，从而发展为左室心肌扩张[8]。有研究报道TNFR1主要介导心肌细胞毒作用和损害作用，TNFR2主要介导心肌的保护作用[9-10]。在大鼠急性心肌梗死和缺血冉灌注模型中，通过在局部缺血心肌处注入表达可溶性TNFR1的质粒可以抑制TNF生物学活性，进而抑制心肌细胞凋亡，减少心肌梗死面积[11-12]。在TNF受体敲除的大鼠急性心肌梗死模型中，发现早期心肌梗死中内源性TNF可通过抑制心肌细胞凋亡起心脏保护作用[13]。由于TNF-α及其受体的多样性、复杂性、交叉性及其在心力衰竭发生发展过程中的重要性，有必要对其进行更全面更深入的研究。

在本实验中，通过超声心动图和心功能检测证实我们成功建立了胸主动脉缩窄诱导的压力负荷性小鼠心肌肥厚这一经典动物模型，并初步检测了术后2周时假手术组和手术组小鼠心肌组织中两型TNF-α及其受体的表达情况。通过以上实验我们证实：在BALB/c小鼠中，相对于假手术组，胸主动脉缩窄术后2周可以出现明显的心肌肥厚；而在该模型中相对于假手术组来说，手术组小鼠心肌组织中sTNF-α和tmTNF-α表达量均有明显增加，但sTNF-α增加较tmTNF-α增加更为明显；同样，手术组小鼠心肌组织中两种TNF-α受体表达也较假手术组明显增加，但TNFR1表达量较TNFR2表达更多。有文献报道，相对于野生组小鼠，心肌特异性高表达sTNF-α转基因小鼠4周时可发生心肌肥厚，而12周时小鼠心脏发生明显心肌扩张[13]。与我们的实验结果一致，TAC术后两周心肌肥厚（代偿期），此阶段以上调sTNF/TNFR1为主，其对心肌细胞的负性调节作用在该病理过程中起了更为主导的作用。然而，由于tmTNF-α是TNFR2的主要配体[5]，我们推测：tmTNF-α与TNFR2结合可能介导了部分心肌保护。而对于两型TNF-α及其受体相互关系和作用，及其下游信号中对心肌肥厚相关信号分子（如JNK，ERK，MAPK及NFκB等）调节和影响需要进一步探索和研究。从中发现关键通路和关键因子，从而为解决临床试验中出现的问题提供解决方案和新的思路。

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（收稿日期：2013-08-09）